分离的多肽、核酸及其应用
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体地，涉及分离的多肽、核酸及其应用，更具体地，涉及分离的多肽、核酸、构建体、重组细胞、提高肌肽合成酶活性的方法和制备肌肽的方法。
背景技术
L-肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸)是由β-丙氨酸和组氨酸组成的二肽，在脊椎动物的骨骼肌和中枢神经系统中具有较高浓度(Boldyrev，2013)。L-肌肽在体内具有许多重要的生理功能，包括抗氧化，抗糖化以及细胞质间缓冲作用和消除自由基等。因此L-肌肽作为一种具有生物活性化合物而备受关注，并广泛用于医药，化妆品，食品添加剂等领域(Yin etal.2019)。利用化学合成法生产L-肌肽的研究已被广泛报道，是目前工业生产的主要方法。化学合成法工艺复杂，会产生许多有毒物质，并且反应条件苛刻，能耗大，不符合绿色化学的要求。
因此有必要开发新的方法予以取代。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与野生型肌肽合成酶SEQ ID NO:1相比，所述多肽具有310位氨基酸突变。发明人经过大量的研究发现，对野生型肌肽合成酶的310位氨基酸进行突变可以改变肌肽合成酶的活性，突变的氨基酸类型不同，对酶活性的影响不同，例如，有些类型的氨基酸可以大幅降低酶活，有些可以使酶失去催化肌肽合成的活性，有些可以大幅提高酶活，进而提高合成肌肽的转化率。
根据本发明的实施例，上述分离的多肽还具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，与野生型肌肽合成酶SEQ ID NO:1相比，所述多肽具有p.Gly310Ala或p.Gly310Ser。发明人经过大量的研究发现，野生型肌肽合成酶的310位氨基酸由甘氨酸突变为丙氨酸时，可以大幅提高肌肽合成酶的活性，可以将酶活提高26％；野生型肌肽合成酶的310位氨基酸由甘氨酸突变为丙氨酸时丝氨酸时，也可以提高肌肽合成酶的活性。
根据本发明的实施例，所述多肽具有SEQ ID NO:2或3所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2或3所示的氨基酸序列相比具有至少95％同一性的氨基酸序列。
LIISSVSAAEPIRARDLGIPFDGQPGSLNAITDVAGVEVGQVTLIDGEGALLVGSGPVRTGVTVIHPRGRNSTDPVFAGWFALNASGEMTGTTWLEERGMVDGPIAITNTHSVGVVRDAAVAWMVEQGWPADWHAPVVAETYDGGLNDINGFHVTREHALEAMAKARTGVVEEGVVGGGTGMVCNGFKGGIGTSSRVFDALGRSFTVGILVQCNYNWDGEQDLRIGGKNMSGLLPVGKHCFIYRDVPRHVNWYPYCDDSSANDELDKPTRDGSIIIIVATDAPLLPHQLRRLAKRPALGLGRLGGISSDGSGDIFLAFSTASPGLINENEESTISMFPNNGLSVVFEAAVQATEEAIVNAMVAAETVVGASGLQVEEMPEDQLRAIFLD(SEQ ID NO:1)
LIISSVSAAEPIRARDLGIPFDGQPGSLNAITDVAGVEVGQVTLIDGEGALLVGSGPVRTGVTVIHPRGRNSTDPVFAGWFALNASGEMTGTTWLEERGMVDGPIAITNTHSVGVVRDAAVAWMVEQGWPADWHAPVVAETYDGGLNDINGFHVTREHALEAMAKARTGVVEEGVVGGGTGMVCNGFKGGIGTSSRVFDALGRSFTVGILVQCNYNWDGEQDLRIGGKNMSGLLPVGKHCFIYRDVPRHVNWYPYCDDSSANDELDKPTRDGSIIIIVATDAPLLPHQLRRLAKRPALGLGRLGGISSDASGDIFLAFSTASPGLINENEESTISMFPNNGLSVVFEAAVQATEEAIVNAMVAAETVVGASGLQVEEMPEDQLRAIFLD(SEQ ID NO:2)
LIISSVSAAEPIRARDLGIPFDGQPGSLNAITDVAGVEVGQVTLIDGEGALLVGSGPVRTGVTVIHPRGRNSTDPVFAGWFALNASGEMTGTTWLEERGMVDGPIAITNTHSVGVVRDAAVAWMVEQGWPADWHAPVVAETYDGGLNDINGFHVTREHALEAMAKARTGVVEEGVVGGGTGMVCNGFKGGIGTSSRVFDALGRSFTVGILVQCNYNWDGEQDLRIGGKNMSGLLPVGKHCFIYRDVPRHVNWYPYCDDSSANDELDKPTRDGSIIIIVATDAPLLPHQLRRLAKRPALGLGRLGGISSDSSGDIFLAFSTASPGLINENEESTISMFPNNGLSVVFEAAVQATEEAIVNAMVAAETVVGASGLQVEEMPEDQLRAIFLD(SEQ ID NO:3)在本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述分离的核酸与野生型肌肽合酶基因SEQ ID NO:4相比，具有下列突变组合的至少之一：c.929G>C和c.930C>T；和c.928G>Cc.929G>C和c.930C>T。
根据本发明的实施例，上述分离的核酸还具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述核酸具有SEQ ID NO:5～7任一所示的核苷酸序列或者与SEQ ID NO:5～7任一所示的核苷酸序列相比具有至少95％同源性的核苷酸序列。
CTGATCATCAGCAGCGTTAGCGCGGCGGAACCGATCCGTGCGCGTGATCTGGGTATTCCGTTCGACGGTCAGCCGGGTTCTCTGAATGCTATTACTGATGTTGCAGGTGTTGAAGTGGGTCAAGTTACCCTGATTGATGGTGAAGGTGCACTGTTAGTGGGTTCCGGCCCGGTTCGTACTGGCGTTACCGTTATCCACCCGCGTGGCCGTAACTCCACTGACCCGGTTTTTGCTGGTTGGTTTGCTCTTAACGCTTCTGGTGAAATGACCGGTACCACTTGGCTGGAAGAACGTGGTATGGTTGACGGTCCGATTGCTATCACCAACACCCACTCTGTGGGCGTTGTTCGTGATGCGGCGGTTGCGTGGATGGTTGAACAGGGTTGGCCGGCGGATTGGCACGCGCCGGTTGTTGCCGAAACCTATGACGGTGGTCTGAACGACATCAACGGCTTCCACGTTACCCGCGAACACGCGCTGGAAGCGATGGCGAAAGCGCGTACCGGCGTTGTTGAAGAAGGCGTTGTTGGTGGTGGTACCGGTATGGTTTGCAACGGCTTCAAAGGCGGTATCGGCACTTCTAGCCGTGTTTTTGACGCACTGGGCCGTAGCTTCACCGTAGGTATCCTGGTTCAGTGCAACTATAACTGGGATGGTGAACAGGACCTGCGTATCGGCGGCAAAAACATGAGCGGTCTGCTGCCGGTTGGCAAACATTGCTTTATCTACCGTGACGTGCCGCGTCACGTAAACTGGTACCCGTACTGCGATGATAGCTCCGCGAACGATGAACTGGATAAACCGACCCGTGACGGTTCCATCATCATCATCGTGGCGACCGATGCGCCGCTGCTGCCGCACCAGCTGCGCCGCCTGGCGAAACGTCCGGCTCTGGGTCTGGGTCGTCTGGGCGGCATCTCTTCCGATGGCTCTGGCGACATCTTCCTGGCGTTCTCTACCGCGTCGCCGGGCCTGATTAACGAAAACGAAGAATCCACCATTTCCATGTTCCCGAACAACGGCCTGTCTGTTGTTTTCGAAGCGGCGGTGCAGGCGACCGAAGAAGCGATCGTTAACGCGATGGTTGCGGCGGAAACCGTTGTGGGTGCGAGCGGTCTGCAGGTTGAAGAAATGCCGGAAGATCAGCTGCGTGCTATCTTCCTGGAT(SEQ ID NO:4)
CTGATCATCAGCAGCGTTAGCGCGGCGGAACCGATCCGTGCGCGTGATCTGGGTATTCCGTTCGACGGTCAGCCGGGTTCTCTGAATGCTATTACTGATGTTGCAGGTGTTGAAGTGGGTCAAGTTACCCTGATTGATGGTGAAGGTGCACTGTTAGTGGGTTCCGGCCCGGTTCGTACTGGCGTTACCGTTATCCACCCGCGTGGCCGTAACTCCACTGACCCGGTTTTTGCTGGTTGGTTTGCTCTTAACGCTTCTGGTGAAATGACCGGTACCACTTGGCTGGAAGAACGTGGTATGGTTGACGGTCCGATTGCTATCACCAACACCCACTCTGTGGGCGTTGTTCGTGATGCGGCGGTTGCGTGGATGGTTGAACAGGGTTGGCCGGCGGATTGGCACGCGCCGGTTGTTGCCGAAACCTATGACGGTGGTCTGAACGACATCAACGGCTTCCACGTTACCCGCGAACACGCGCTGGAAGCGATGGCGAAAGCGCGTACCGGCGTTGTTGAAGAAGGCGTTGTTGGTGGTGGTACCGGTATGGTTTGCAACGGCTTCAAAGGCGGTATCGGCACTTCTAGCCGTGTTTTTGACGCACTGGGCCGTAGCTTCACCGTAGGTATCCTGGTTCAGTGCAACTATAACTGGGATGGTGAACAGGACCTGCGTATCGGCGGCAAAAACATGAGCGGTCTGCTGCCGGTTGGCAAACATTGCTTTATCTACCGTGACGTGCCGCGTCACGTAAACTGGTACCCGTACTGCGATGATAGCTCCGCGAACGATGAACTGGATAAACCGACCCGTGACGGTTCCATCATCATCATCGTGGCGACCGATGCGCCGCTGCTGCCGCACCAGCTGCGCCGCCTGGCGAAACGTCCGGCTCTGGGTCTGGGTCGTCTGGGCGGCATCTCTTCCGATGGCTCTGCTGACATCTTCCTGGCGTTCTCTACCGCGTCGCCGGGCCTGATTAACGAAAACGAAGAATCCACCATTTCCATGTTCCCGAACAACGGCCTGTCTGTTGTTTTCGAAGCGGCGGTGCAGGCGACCGAAGAAGCGATCGTTAACGCGATGGTTGCGGCGGAAACCGTTGTGGGTGCGAGCGGTCTGCAGGTTGAAGAAATGCCGGAAGATCAGCTGCGTGCTATCTTCCTGGAT(SEQ ID NO:5)
CTGATCATCAGCAGCGTTAGCGCGGCGGAACCGATCCGTGCGCGTGATCTGGGTATTCCGTTCGACGGTCAGCCGGGTTCTCTGAATGCTATTACTGATGTTGCAGGTGTTGAAGTGGGTCAAGTTACCCTGATTGATGGTGAAGGTGCACTGTTAGTGGGTTCCGGCCCGGTTCGTACTGGCGTTACCGTTATCCACCCGCGTGGCCGTAACTCCACTGACCCGGTTTTTGCTGGTTGGTTTGCTCTTAACGCTTCTGGTGAAATGACCGGTACCACTTGGCTGGAAGAACGTGGTATGGTTGACGGTCCGATTGCTATCACCAACACCCACTCTGTGGGCGTTGTTCGTGATGCGGCGGTTGCGTGGATGGTTGAACAGGGTTGGCCGGCGGATTGGCACGCGCCGGTTGTTGCCGAAACCTATGACGGTGGTCTGAACGACATCAACGGCTTCCACGTTACCCGCGAACACGCGCTGGAAGCGATGGCGAAAGCGCGTACCGGCGTTGTTGAAGAAGGCGTTGTTGGTGGTGGTACCGGTATGGTTTGCAACGGCTTCAAAGGCGGTATCGGCACTTCTAGCCGTGTTTTTGACGCACTGGGCCGTAGCTTCACCGTAGGTATCCTGGTTCAGTGCAACTATAACTGGGATGGTGAACAGGACCTGCGTATCGGCGGCAAAAACATGAGCGGTCTGCTGCCGGTTGGCAAACATTGCTTTATCTACCGTGACGTGCCGCGTCACGTAAACTGGTACCCGTACTGCGATGATAGCTCCGCGAACGATGAACTGGATAAACCGACCCGTGACGGTTCCATCATCATCATCGTGGCGACCGATGCGCCGCTGCTGCCGCACCAGCTGCGCCGCCTGGCGAAACGTCCGGCTCTGGGTCTGGGTCGTCTGGGCGGCATCTCTTCCGATTCTTCTGGCGACATCTTCCTGGCGTTCTCTACCGCGTCGCCGGGCCTGATTAACGAAAACGAAGAATCCACCATTTCCATGTTCCCGAACAACGGCCTGTCTGTTGTTTTCGAAGCGGCGGTGCAGGCGACCGAAGAAGCGATCGTTAACGCGATGGTTGCGGCGGAAACCGTTGTGGGTGCGAGCGGTCTGCAGGTTGAAGAAATGCCGGAAGATCAGCTGCGTGCTATCTTCCTGGAT(SEQ ID NO:6)
CTGATCATCAGCAGCGTTAGCGCGGCGGAACCGATCCGTGCGCGTGATCTGGGTATTCCGTTCGACGGTCAGCCGGGTTCTCTGAATGCTATTACTGATGTTGCAGGTGTTGAAGTGGGTCAAGTTACCCTGATTGATGGTGAAGGTGCACTGTTAGTGGGTTCCGGCCCGGTTCGTACTGGCGTTACCGTTATCCACCCGCGTGGCCGTAACTCCACTGACCCGGTTTTTGCTGGTTGGTTTGCTCTTAACGCTTCTGGTGAAATGACCGGTACCACTTGGCTGGAAGAACGTGGTATGGTTGACGGTCCGATTGCTATCACCAACACCCACTCTGTGGGCGTTGTTCGTGATGCGGCGGTTGCGTGGATGGTTGAACAGGGTTGGCCGGCGGATTGGCACGCGCCGGTTGTTGCCGAAACCTATGACGGTGGTCTGAACGACATCAACGGCTTCCACGTTACCCGCGAACACGCGCTGGAAGCGATGGCGAAAGCGCGTACCGGCGTTGTTGAAGAAGGCGTTGTTGGTGGTGGTACCGGTATGGTTTGCAACGGCTTCAAAGGCGGTATCGGCACTTCTAGCCGTGTTTTTGACGCACTGGGCCGTAGCTTCACCGTAGGTATCCTGGTTCAGTGCAACTATAACTGGGATGGTGAACAGGACCTGCGTATCGGCGGCAAAAACATGAGCGGTCTGCTGCCGGTTGGCAAACATTGCTTTATCTACCGTGACGTGCCGCGTCACGTAAACTGGTACCCGTACTGCGATGATAGCTCCGCGAACGATGAACTGGATAAACCGACCCGTGACGGTTCCATCATCATCATCGTGGCGACCGATGCGCCGCTGCTGCCGCACCAGCTGCGCCGCCTGGCGAAACGTCCGGCTCTGGGTCTGGGTCGTCTGGGCGGCATCTCTTCTGACGCTTCTGGTGACATCTTCCTGGCGTTCTCTACCGCGTCGCCGGGCCTGATTAACGAAAACGAAGAATCCACCATTTCCATGTTCCCGAACAACGGCCTGTCTGTTGTTTTCGAAGCGGCGGTGCAGGCGACCGAAGAAGCGATCGTTAACGCGATGGTTGCGGCGGAAACCGTTGTGGGTGCGAGCGGTCTGCAGGTTGAAGAAATGCCGGAAGATCAGCTGCGTGCTATCTTCCTGGAT(SEQ ID NO:7)
CTGATCATCAGCAGCGTTAGCGCGGCGGAACCGATCCGTGCGCGTGATCTGGGTATTCCGTTCGACGGTCAGCCGGGTTCTCTGAATGCTATTACTGATGTTGCAGGTGTTGAAGTGGGTCAAGTTACCCTGATTGATGGTGAAGGTGCACTGTTAGTGGGTTCCGGCCCGGTTCGTACTGGCGTTACCGTTATCCACCCGCGTGGCCGTAACTCCACTGACCCGGTTTTTGCTGGTTGGTTTGCTCTTAACGCTTCTGGTGAAATGACCGGTACCACTTGGCTGGAAGAACGTGGTATGGTTGACGGTCCGATTGCTATCACCAACACCCACTCTGTGGGCGTTGTTCGTGATGCGGCGGTTGCGTGGATGGTTGAACAGGGTTGGCCGGCGGATTGGCACGCGCCGGTTGTTGCCGAAACCTATGACGGTGGTCTGAACGACATCAACGGCTTCCACGTTACCCGCGAACACGCGCTGGAAGCGATGGCGAAAGCGCGTACCGGCGTTGTTGAAGAAGGCGTTGTTGGTGGTGGTACCGGTATGGTTTGCAACGGCTTCAAAGGCGGTATCGGCACTTCTAGCCGTGTTTTTGACGCACTGGGCCGTAGCTTCACCGTAGGTATCCTGGTTCAGTGCAACTATAACTGGGATGGTGAACAGGACCTGCGTATCGGCGGCAAAAACATGAGCGGTCTGCTGCCGGTTGGCAAACATTGCTTTATCTACCGTGACGTGCCGCGTCACGTAAACTGGTACCCGTACTGCGATGATAGCTCCGCGAACGATGAACTGGATAAACCGACCCGTGACGGTTCCATCATCATCATCGTGGCGACCGATGCGCCGCTGCTGCCGCACCAGCTGCGCCGCCTGGCGAAACGTCCGGCTCTGGGTCTGGGTCGTCTGGGCGGCATCTCTTCTGACTCTTCTGGTGACATCTTCCTGGCGTTCTCTACCGCGTCGCCGGGCCTGATTAACGAAAACGAAGAATCCACCATTTCCATGTTCCCGAACAACGGCCTGTCTGTTGTTTTCGAAGCGGCGGTGCAGGCGACCGAAGAAGCGATCGTTAACGCGATGGTTGCGGCGGAAACCGTTGTGGGTGCGAGCGGTCTGCAGGTTGAAGAAATGCCGGAAGATCAGCTGCGTGCTATCTTCCTGGAT(SEQ ID NO:8)
根据本发明的实施例，SEQ ID NO:5所示的序列是SEQ ID NO:4中的第928～930位的核苷酸由GGC突变为GCT，氨基酸突变由Gly突变为Ala。
根据本发明的实施例，SEQ ID NO:6所示的序列是SEQ ID NO:4中的第928～930位的核苷酸由GGC突变为TCT，对应多肽中的氨基酸突变由Gly突变为Ser。
根据本发明的实施例，SEQ ID NO:7所示的序列是SEQ ID NO:5中的第928～930位的核苷酸第922～927位突变为TCT GAC，第931～936位突变为TCTGGT。上述核苷酸突变可以使核酸更适应大肠杆菌表达系统，更好地合成肌肽合酶。
根据本发明的实施例，SEQ ID NO:8所示的序列是SEQ ID NO:6中的第928～930位的核苷酸第922～927位突变为TCT GAC，第931～936位突变为TCTGGT。上述核苷酸突变可以使核酸更适应大肠杆菌表达系统，更好地合成肌肽合酶。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包含在本发明第二方面所提出的核酸。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过本发明第三方面所提出的构建体转化受体细胞获得的。
根据本发明的实施例，上述重组细胞还具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述重组细胞为大肠杆菌。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种提高肌肽合成酶活性的方法。根据本发明的实施例，使所述肌肽合成酶的第310位氨基酸发生突变。根据本发明的实施例，发明人经过大量的研究发现，通过将肌肽合酶310位氨基酸突变为特定的氨基酸类型可以提高肌肽合成酶的酶活。
根据本发明的实施例，上述方法还具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，使所述肌肽合成酶的第310位Gly突变为Ala或Ser。根据本发明的实施例，在蛋白质化学合成或生物合成中，将肌肽合成酶的第310位Gly突变为Ala或Ser，不改变其他位点的氨基酸类型，可以提高肌肽合成酶的活性。
在本发明的第六方面，本发明提出了本发明第一方面提出的多肽、本发明第二方面提出的核酸、本发明第三方面提出的构建体、本发明第四方面提出的重组细胞在制备L-肌肽中的用途。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种制备肌肽的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括:将如本发明第一方面所提出的多肽与β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生物进行催化反应，以便获得所述肌肽。根据本发明的实施例，上述多肽与β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生物以及组氨酸进行反应，可以催化生成肌肽，并且转化率相对野生型肌肽合成酶高。
根据本发明的实施例，上述方法还具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述多肽是由上述重组细胞表达的。根据本发明的实施例，所述重组细胞，包括哺乳动物细胞、感受态细胞、细菌、真菌、酵母等，其核酸可以被特异性改造，例如特异性改造为可以高效生产肌肽合成酶的工程细胞株或菌株等。
根据本发明的实施例，所述方法包括将所述大肠杆菌在所述β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生物存在的条件下进行发酵处理，以便获得所述肌肽。
根据本发明的实施例，所述β-丙氨酸甲酯盐为β-丙氨酸甲酯盐酸盐。根据本发明的实施例，本发明所提出的肌肽合成酶以β-丙氨酸甲酯或衍生物以及组氨酸为底物，可以高效生产肌肽。
根据本发明的实施例，所述发酵处理是在包含组氨酸的发酵培养基中进行的。
根据本发明的实施例，所述组氨酸与β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生物的摩尔比为(1～12):5,优选为1:1。
根据本发明的实施例，所述发酵处理是在温度为25～35摄氏度，优选30摄氏度的条件下进行3～6小时，优选为4小时，更优选为4.5小时。
根据本发明的实施例，所述发酵处理的初始pH为6～8，优选为7。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种制备肌肽的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将上述大肠杆菌在发酵培养基中进行3～6小时的发酵处理，所述发酵培养基中包括L-组氨酸与β-丙氨酸甲酯盐酸盐，所述发酵处理的温度为25～35摄氏度，所述发酵处理的初始pH为6～8；其中，所述L-组氨酸与β-丙氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为(1～12):5,优选为1:1。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的不同突变体的酶活；
图2是根据本发明实施例的310位点饱和突变体的酶活检测结果；
图3是根据本发明实施例的不同浓度β-丙氨酸甲酯盐酸盐下的酶活检测结果；
图4是根据本发明实施例的不同初始pH下的酶活结果；
图5是根据本发明实施例的不同培养温度下的酶活结果；
图6是根据本发明实施例的不同培养时间下的酶活结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本文中使用的术语“核酸”是指由两种或更多种单体(包括核苷酸、核苷或其类似物)组成的有机聚合物，包括但不限于任意长度的单链或双链、有义或反义脱氧核糖核酸(DNA)，有义或反义核糖核酸(RNA)包括siRNA。术语“核苷酸”是指由结合到嘌呤或嘧啶碱基并结合到磷酸基团的核糖或脱氧核糖组成的多种化合物的任一种，并且它们是核酸的基本结构单元。术语“核苷”是指由与脱氧核糖或核糖组合的嘌呤或嘧啶碱基组成的化合物(如鸟苷或腺苷)，并且其存在于核酸中。
应当理解，本文描述的“核酸”的含义中包括“基因”，并且本文描述的核酸还包括“载体”或“质粒”。
应当理解，本文中描述的多肽的氨基酸突变，其对应的核苷酸序列应具有多种，即根据密码子规则，一种氨基酸可对应多种密码子，进而对应多种脱氧核糖核苷酸序列组合形式，例如，Ala对应的密码子为GCU,GCC,GCA,GCG，上述不同密码子对应的脱氧核糖核苷酸序列不同，但最终都可对应形成Ala氨基酸。
在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受限制，其包括但不限于质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒中的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。
多肽
在本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与野生型肌肽合成酶SEQ ID NO:1相比，所述多肽具有310位氨基酸突变。发明人经过大量的研究发现，对野生型肌肽合成酶的310位氨基酸进行突变可以改变肌肽合成酶的活性，突变的氨基酸类型不同，对酶活性的影响不同，例如，有些类型的氨基酸可以大幅降低酶活，有些可以使酶失去催化肌肽合成的活性，有些可以大幅提高酶活，进而提高合成肌肽的转化率。
根据本发明具体的实施例，对野生型肌肽合成酶进行如下位点突变，可以使肌肽合成酶失去催化活性：W133D，Y142N，Y142K，S86Q或D218E；G310A突变可以大幅提高酶活；S86N/G310A或R270G/G310A的双位点突变后，这些双突变酶对肌肽没有催化活性，说明野生型肌肽合成酶中R270对酶活的调控也很重要。
根据本发明的实施例，与野生型肌肽合成酶SEQ ID NO:1相比，所述多肽具有p.Gly310Ala或p.Gly310Ser。发明人经过大量的研究发现，野生型肌肽合成酶的310位氨基酸由甘氨酸突变为丙氨酸时，可以大幅提高肌肽合成酶的活性，可以将酶活提高26％；野生型肌肽合成酶的310位氨基酸由甘氨酸突变为丙氨酸时丝氨酸时，也可以提高肌肽合成酶的活性。
根据本发明的实施例，所述多肽具有SEQ ID NO:2或3所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2或3所示的氨基酸序列相比具有至少95％同一性的氨基酸序列，进一步地，所述多肽具有SEQ ID NO:2或3所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2或3所示的氨基酸序列相比具有95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的氨基酸序列。
核酸
在本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述分离的核酸与野生型肌肽合酶基因SEQ ID NO:4相比，具有下列突变组合的至少之一：c.929G>C和c.930C>T；和c.928G>Cc.929G>C和c.930C>T。
根据本发明的实施例，上述分离的核酸还具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述核酸具有SEQ ID NO:5～7任一项所示的核苷酸序列或者与SEQ ID NO:5～7任一项所示的核苷酸序列相比具有至少95％同源性的核苷酸序列。
构建体和重组细胞
在本发明的第三方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包含在本发明第二方面所提出的核酸。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过本发明第三方面所提出的构建体转化受体细胞获得的。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为大肠杆菌。
根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞，能够有效地生产肌肽。
根据本发明的实施例，受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细胞来源于大肠杆菌细胞。
提高肌肽合成酶活性的方法
在本发明的第五方面，本发明提出了一种提高肌肽合成酶活性的方法。根据本发明的实施例，使所述肌肽合成酶的第310位氨基酸发生突变。根据本发明的实施例，发明人经过大量的研究发现，通过将肌肽合酶310位氨基酸突变为特定的氨基酸类型可以提高肌肽合成酶的酶活。
根据本发明的实施例，使所述肌肽合成酶的第310位Gly突变为Ala或Ser。根据本发明的实施例，在蛋白质化学合成或生物合成中，将肌肽合成酶的第310位Gly突变为Ala或Ser，不改变其他位点的氨基酸类型，可以提高肌肽合成酶的活性。
制备肌肽的方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备肌肽的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括:将如本发明第一方面所提出的多肽与β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生物进行催化反应，以便获得所述肌肽。根据本发明的实施例，上述多肽与β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生物以及组氨酸进行反应，可以催化生成肌肽，并且转化率相对野生型肌肽合成酶高。
根据本发明的实施例，所述多肽是由上述重组细胞表达的。根据本发明的实施例，所述重组细胞，包括哺乳动物细胞、感受态细胞、细菌、真菌、酵母等，其核酸可以被特异性改造，例如特异性改造为可以高效生产肌肽合成酶的工程细胞株或菌株等。
根据本发明的实施例，所述方法包括将所述大肠杆菌在所述β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生物存在的条件下进行发酵处理，以便获得所述肌肽。
根据本发明的实施例，所述β-丙氨酸甲酯盐为β-丙氨酸甲酯盐酸盐。根据本发明的实施例，本发明所提出的肌肽合成酶以β-丙氨酸甲酯或衍生物以及组氨酸为底物，可以高效生产肌肽。
根据本发明的实施例，所述发酵处理是在包含组氨酸的发酵培养基中进行的。
根据本发明的实施例，所述组氨酸与β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生物的摩尔比为(1～12):5,优选为1:1。
根据本发明具体的实施例，所述组氨酸为L-组氨酸。
根据本发明的具体实施例，所述肌肽为L-肌肽。
根据本发明的实施例，所述发酵处理是在温度为25～35摄氏度，优选30摄氏度的条件下进行3～6小时。
根据本发明的实施例，所述发酵处理的初始pH为6～8，优选为7。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
材料与方法
菌株和培养条件
用于表达L-肌肽合成酶的野生型DNA序列(SEQ ID NO:4)由上海生工生物技术有限公司合成，然后通过NcoI和XhoI酶切位点插入到pET-26b质粒中，得到重组质粒pET26b-WTCar。该质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中表达。重组菌株在含有40μg/ml卡那霉素的LB培养基，37℃，200rpm培养过夜。然后将2mL的菌液接种到200mL含有40μg/ml新鲜LB培养基中。但OD600值在0.6～0.8左右时，添加0.02mM的IPTG在16℃诱导过夜表达。
具有同源序列的氨基肽酶建模
使用BLAST程序在蛋白质数据库(PDB)进行序列相似度搜索。以与野生型的L-氨基肽酶序列(SEQ ID NO:1)相似蛋白的x射线晶体结构(PDB code:1b65)作为模板。通过序列比对，使用Modeller 9v21生成L-氨基肽酶的三维模型。
底物与氨基酸的匹配
然后将生成的模型与鞘氨菌(Sphingosinicella xenopeptiytica)的氨基肽酶的x射线晶体结构(PDB code:3nfb)进行叠加。然后用PyMol v0.99软件将3nfb中的底物提取到L-氨基肽酶的相应活性位点。在虚拟筛选中，筛选出与活性位点距离小于的氨基酸残基。
计算机辅助饱和突变
使用了计算机模拟饱和突变方法，进一步提高L-肌肽合成酶的活性。具体来说，就是将在活性位点上识别的每个氨基酸残基突变为其他类型的氨基酸，并利用AutoDockVina预测L-肌肽合成酶与底物结合后的构象。随后利用PCR进行点突变，以pET26b-WTCar为模板，突变所使用的引物见表1，使用高保真Q5 DNA聚合酶(New England Biolabs，北京，中国)构建突变质粒。并利用DpNI在37℃酶切2h用于去除残留的质粒。构建的突变质粒W133D、Y142N、Y142K、S86Q、D218E、G310A和双突变质粒S86N/G310A和R270G/G310A。还对G310进行了饱和突变，所使用的引物见表2。以上所有质粒均通过测序验证。
表1：突变体构建所使用的引物
表2：G310饱和突变所使用的引物
酶活检测
为了筛选出最佳酶，采用了全细胞反应法测定酶活性。将诱导表达的细胞5000rpm离心5min，细菌沉淀用Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH＝10.0)洗涤两次，随后悬浮在该缓冲液中，调整OD600为20。底物浓度设定为10mM的β-丙氨酸-酰胺和50mM的L-组氨酸(Heyland etal.2010)。反应在30℃,200rpm条件下进行，通过加入0.3M HCl停止反应。使用高效液相色谱(HPLC)测定样品浓度。还使用了另外两种β-丙氨酸供体，β-丙氨酸甲酯盐酸盐(β-AlaOMe)和β-丙氨酸乙酯盐酸盐(β-AlaOEt)，作为底物替代β-丙氨酸-酰胺用以进行反应。根据β-丙氨酸酰胺转化率定义酶活为100％
突变蛋白的酶活测定均使用的是纯化后的酶。所有带有his标记的酶都是通过试剂盒利用Ni-琼脂糖的方法纯化(CoWin Biosciences Co.，北京，中国)。酶促反应体系包括10mM的β-丙氨酸甲酯盐酸盐,50mM的L-组氨酸，以及溶解于Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH＝10)中终浓度为74μg/mL的酶。反应在30℃水浴中进行，通过添加50μL 6M的盐酸使反应停止，并利用HPLC分析。
实施例1
一、重组质粒的构建
1、针对大肠杆菌系统的将从深海宏基因组文库中发现的β-氨基肽酶序列基因密码子优化，合成相关基因(SEQ ID NO:4)。
2、取步骤1合成的基因，利用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切，回收酶切产物。
3、取pET-26b质粒，用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切，回收载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pET26b-WTCar。根据测序结果，对重组质粒pET26b-WTCar进行结构描述如下：在pET-26b质粒的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了SEQ ID NO:4所示的DNA分子。SEQ ID NO:4所示的DNA分子，编码SEQ IDNO:1所示的野生型蛋白。
5、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用W133D-F和W133D-R组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(W133D)。将重组质粒pET26b-WTCar(W133D)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(W133D)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第397-399位核苷酸由“TGG”突变为了“GAC”。突变后的DNA分子编码W133D突变体蛋白。
6、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用Y142N-F和Y142N-R组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(Y142N)。将重组质粒pET26b-WTCar(Y142N)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(Y142N)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第424-426位核苷酸由“TAT”突变为了“AAC”。突变后的DNA分子编码Y142N突变体蛋白。
7、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用Y142K-F和Y142K-R组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(Y142K)。将重组质粒pET26b-WTCar(Y142K)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(Y142K)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第424-426位核苷酸由“TAT”突变为了“AAA”。突变后的DNA分子编码Y142K突变体蛋白。
8、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用S86Q-F和S86Q-R组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(S86Q)。将重组质粒pET26b-WTCar(S86Q)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(S86Q)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第256-258位核苷酸由“TCT”突变为了“CAG”。突变后的DNA分子编码S86Q突变体蛋白。
9、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用D218E-F和D218E-R组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(D218E)。将重组质粒pET26b-WTCar(D218E)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(D218E)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第652-654位核苷酸由“GAT”突变为了“GAA”。突变后的DNA分子编码D218E突变体蛋白。
10、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用D218E-F和D218E-R组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(D218E)。将重组质粒pET26b-WTCar(D218E)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(D218E)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第652-654位核苷酸由“GAT”突变为了“GAA”。突变后的DNA分子编码D218E突变体蛋白。
11、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用G310A-F和G310A-R组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310A)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310A)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310A)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“GCT”。突变后的DNA分子编码G310A突变体蛋白。
12、以重组质粒pET26b-WTCar(G310A)为模板，采用S86NG310A-F和S86NG310A-R组成的引物对进行两点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(S86NG310A)。将重组质粒pET26b-WTCar(S86NG310A)进行测序，测序结果表明，与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(S86NG310A)的差异仅在于将序列2所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“GCT”，并且将序列4所示DNA分子第256-258位核苷酸由“TCT”替换为了“AAC”，突变后的DNA分子编码S86NG310A突变体蛋白。
13、以重组质粒pET26b-WTCar(G310A)为模板，采用R270GG310A-F和R270GG310A-R组成的引物对进行两点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(R270GG310A)。将重组质粒pET26b-WTCar(R270GG310A)进行测序，测序结果表明，与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(S86NG310A)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“GCT”，并且将序列4所示DNA分子第808-810位核苷酸由“ARG”替换为了“GGT”，突变后的DNA分子编码S86NG310A突变体蛋白。
14、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310K-f和carnosine G310K-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310K)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310K)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310K)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“AAA”。突变后的DNA分子编码G310K突变体蛋白。
15、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310P-f和carnosine G310P-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310P)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310P)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310P)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“CCG”。突变后的DNA分子编码G310P突变体蛋白。
16、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310R-f和carnosine G310R-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310R)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310R)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310R)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“CGT”。突变后的DNA分子编码G310R突变体蛋白。
17、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310T-f和carnosine G310T-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310T)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310T)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310T)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“ACC”。突变后的DNA分子编码G310T突变体蛋白。
18、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310D-f和carnosine G310D-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310D)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310D)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310D)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“GAC”。突变后的DNA分子编码G310D突变体蛋白。
19、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310S-f和carnosine G310S-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310S)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310S)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310S)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“GTC”。突变后的DNA分子编码G310S突变体蛋白。
20、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310I-f和carnosine G310I-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310I)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310I)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310I)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“ATC”。突变后的DNA分子编码G310I突变体蛋白。
21、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310V-f和carnosine G310V-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310V)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310V)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310V)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“GTT”。突变后的DNA分子编码G310V突变体蛋白。
22、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310L-f和carnosine G310L-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310L)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310L)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310L)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“CTG”。突变后的DNA分子编码G310L突变体蛋白。
23、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310H-f和carnosine G310H-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310H)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310H)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310H)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“CAC”。突变后的DNA分子编码G310H突变体蛋白。
24、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310Q-f和carnosine G310Q-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310Q)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310Q)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310Q)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“CAG”。突变后的DNA分子编码G310Q突变体蛋白。
25、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310F-f和carnosine G310F-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310H)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310F)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310F)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“TTC”。突变后的DNA分子编码G310F突变体蛋白。
26、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310N-f和carnosine G310N-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310H)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310N)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310N)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“AAC”。突变后的DNA分子编码G310N突变体蛋白。
27、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310E-f和carnosine G310E-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310E)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310E)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310E)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“GAA”。突变后的DNA分子编码G310E突变体蛋白。
28、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310M-f和carnosine G310M-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310M)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310M)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310M)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“ATG”。突变后的DNA分子编码G310M突变体蛋白。
29、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310W-f和carnosine G310W-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310W)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310W)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310W)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“TGG”。突变后的DNA分子编码G310W突变体蛋白。
30、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310C-f和carnosine G310C-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310C)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310C)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310C)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“TGC”。突变后的DNA分子编码G310C突变体蛋白。
31、以重组质粒pET26b-WTCar模板，采用carnosine G310Y-f和carnosine G310Y-r组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET26b-WTCar(G310Y)。将重组质粒pET26b-WTCar(G310Y)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET26b-WTCar相比，重组质粒pET26b-WTCar(G310Y)的差异仅在于将序列4所示DNA分子第928-930位核苷酸由“GGC”突变为了“TAC”。突变后的DNA分子编码G310Y突变体蛋白。
二、重组菌的构建
将重组质粒pET26b-WTCar导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌WT。
将重组质粒pET26b-WTCar(W133D)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌W133D。
将重组质粒pET26b-WTCar(Y142N)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌Y142N。
将重组质粒pET26b-WTCar(Y142K)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌Y142K。
将重组质粒pET26b-WTCar(S86Q)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌S86Q。
将重组质粒pET26b-WTCar(D218E)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌D218E。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310A)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310A。
将重组质粒pET26b-WTCar(S86NG310A)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌S86NG310A。
将重组质粒pET26b-WTCar(R270GG310A)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌R270GG310A。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310K)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310K。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310P)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310P。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310R)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310R。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310T)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310T。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310D)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310D。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310S)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310S。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310I)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310I。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310V)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310V。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310L)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310L。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310H)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310H。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310Q)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310Q。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310F)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310F。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310N)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310N。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310M)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310M。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310W)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310W。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310C)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310C。
将重组质粒pET26b-WTCar(G310Y)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌G310Y。
实施例2、野生型蛋白以及各个突变体蛋白的全细胞催化及酶活检测
一、蛋白的表达
分别采用实施例1制备的各个重组菌制备N端融合有His6标签的各个蛋白质，具体步骤均如下
1、将重组菌接种至含40μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD600nm值＝0.6-0.8。
2、完成步骤1后，在体系中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)并使其浓度为0.02mM，16℃、200rpm振荡培养8小时。
3、完成步骤2后，离心收集细胞。
4、取步骤3得到的细胞，用结合缓冲液悬浮，然后进行超声破碎(10％的功率，破3秒停5秒，总时间10分钟)，然后12000g离心20分钟，收集上清液。
结合缓冲液(pH7.8)：含20mM Tris-HCl、500mM氯化钠和10mM咪唑，余量为水。
5、取步骤4得到的上清液，采用镍亲和层析纯化目的蛋白。
镍亲和层析的柱子为：Ni-Agarose亲和层析柱(15mL)。
纯化过程：①上样2mL上清液；②用结合缓冲液洗涤15个柱体积；③收集5个柱体积的洗脱缓冲液洗涤，收集洗脱峰。
洗脱缓冲液(pH7.8)：含20mM Tris-HCl、500mM氯化钠和500mM咪唑，余量为水。
6、取步骤5得到的过柱后溶液，采用GE Healthcare公司的脱盐柱，将蛋白的溶剂体系替换为Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH＝10)，得到蛋白溶液。
将实施例1的重组菌构建中得到的重组菌进行上述步骤得到的溶液命名为对应的重组菌溶液。例如：重组菌W133D进行上述步骤得到的溶液命名为W133D溶液。
使用牛血清白蛋白作为标准，通过Bradford方法测定各个溶液中的蛋白质浓度。
二、酶活检测
取步骤一制备的各个细胞溶液，分别作为待测溶液，检测其作为L-肌肽合酶的酶活。
反应体系(1.0ml)：含10mMβ-丙氨酸甲酯盐酸盐、50mM的L-组氨酸、终浓度为74mg/ml的酶，余量为Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH＝10.0)。
反应条件：30℃，200rpm反应。
反应4.5h后添加0.3M的HCl结束反应。
反应产物中的L-肌肽利用高效液相(HPLC)色谱定量。
HPLC检测条件：固定相为NH2柱(200mm 4.6mm,5×m)，流动相为44％乙腈和56％40mmK2HPO4溶液(pH＝6.3，利用磷酸调整pH)。L-肌肽的测定参数为:流速1.0mL/min，紫外检测波长210nm，柱温25℃，注射体积10μL。利用L-肌肽标准品对分析方法进行了验证，使用线性回归曲线定量测定样品中的浓度。
不同突变体结果见图1。图1中，横坐标为不同的突变体。几乎其他所有的突变体都丧失了催化活性，表明该酶的活性对结合口袋结构非常敏感。但G310A突变体的L-肌肽产量比野生型提高26％。
对310位点饱和突变结果见图2，图2中，G310A突变体的酶活最高，G310S次之。
实施例3、G310A突变体全细胞催化合成L-肌肽的影响
为了进一步提高G310A的酶活以及简化工艺流程，通过G310A突变体全细胞催化合成L-肌肽，并优化反应条件。
一、制备全细胞提取物
采用实施例1制备的G310A制备全细胞提取物，具体步骤均如下：
1、将重组菌接种至含40μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD600nm值＝0.6-0.8。
2、完成步骤1后，在体系中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)并使其浓度为0.02mM，16℃、200rpm振荡培养8小时。
3、完成步骤2后，离心收集细胞。
4、取步骤3得到的细胞，用Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH＝10.0)洗涤两次，然后悬浮在该缓冲液中，即为全细胞提取物。
二、不同β-丙氨酸甲酯盐酸盐酶活检测
取步骤一制备的全细胞提取物，分别作为待测溶液，检测其作为L-肌肽合酶的酶活。
反应体系(1.0ml)：分别含10,20,30,50,100mMβ-丙氨酸甲酯盐酸盐、50mM的L-组氨酸、最终OD600＝20的菌液，余量为Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH＝10.0)。
反应条件：初始pH为7.0，30℃，200rpm反应。
反应6h后添加0.3M的HCl结束反应。
反应产物中的L-肌肽利用高效液相(HPLC)色谱定量。
HPLC检测条件：固定相为NH2柱(200mm 4.6mm,5×m)，流动相为44％乙腈和56％40mmK2HPO4溶液(pH＝6.3，利用磷酸调整pH)。L-肌肽的测定参数为:流速1.0mL/min，紫外检测波长210nm，柱温25℃，注射体积10μL。利用L-肌肽标准品对分析方法进行了验证，使用线性回归曲线定量测定样品中的浓度。
结果见图3。图3中，横坐标为递增浓度的β-丙氨酸甲酯盐酸盐，纵坐标为L-肌肽产量。当β-丙氨酸甲酯盐酸盐浓度为50mM时，L-肌肽产量最高，为2.29g/L。
三、不同培养温度的酶活检测
改变培养条件中的培养温度，分别设置为：25℃、30℃、37℃、45℃，其他培养方式与上述“不同β-丙氨酸甲酯盐酸盐酶活检测”相同，检测不同培养温度下的酶活，结果如附图5所示，30℃为反应的最适温度，L-肌肽产量为0.31g/L。
四、不同培养时间的酶活检测
改变培养条件中的培养时间，分别设置为：1h、4.5h、7.5h、16h，其他培养方式与上述“不同β-丙氨酸甲酯盐酸盐酶活检测”相同，检测不同培养时间下的酶活，结果如附图6所示，4.5h是反应的最适时间，L-肌肽产量为0.87g/L。
五、不同初始培养pH酶活检测
改变培养条件中初始pH，分别设置为：6.8、7.2、7.6、8、8.9，培养时间设置为4.5h，其他培养方式与上述“不同β-丙氨酸甲酯盐酸盐酶活检测”相同，检测不同pH下的酶活，结果如附图4所示，6.8是反应的最适pH，L-肌肽产量为1.16g/L。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业大学
<120> 分离的多肽、核酸及其应用
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<213> Artificial Sequence
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<223> Y142N-F
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<213> Artificial Sequence
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<223> Y142N-R
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<213> Artificial Sequence
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<223> Y142K-R
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tcgttcagac caccgtcttt ggtttcagc 29
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> S86Q-R
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> D218E-R
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<223> S86NG310A-R
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