一种用于血清抗体检测的猪丹毒丝菌gapdh分子抗原多肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学
技术领域
，具体涉及一种用于血清抗体检测的猪丹毒丝菌GAPDH分子抗原多肽及其制备方法和应用。背景技术
猪丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae，又称红斑丹毒丝菌、猪丹毒杆菌）是造成猪丹毒的病原。猪丹毒是世界范围内危害养猪业的主要细菌性疫病之一，在我国猪丹毒和猪肺疫、猪瘟曾并称为猪场三大疫病，目前仍然被我国政府列为二类动物疫病。近年来猪丹毒的危害虽然有所降低，但其临床分离或检出率依然位居前列，依然是猪场主要细菌性疫病。猪丹毒同样可以造成人类感染发病（类丹毒），是一种人兽共患病病原菌。
猪丹毒丝菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）分子是优良的保护性抗原，已经被用于亚单位疫苗的研制。评估疫苗免疫效果就需要建立特异性的血清抗体检测方法。由于GAPDH是一种糖酵解酶，在其他细菌中也有存在结构相似的分子，未进行免疫的猪的血清中也容易出现能够与猪丹毒丝菌GAPDH分子发生交叉反应的抗体，因而难以建立起一种高度特异性的血清检测方法以检测猪丹毒丝菌GAPDH抗原的免疫效果。因而寻找猪丹毒丝菌GAPDH特异性序列进而建立起高度特异性的血清抗体检测方法就成为有效利用猪丹毒丝菌GAPDH抗原的必然要求。
本发明的目的是通过鉴定猪丹毒丝菌GAPDH分子的抗原表位，从而获得一种建立GAPDH抗原免疫后血清抗体水平的特异性检测方法所需的抗原氨基酸序列。
发明内容
本发明所解决的技术问题是：通过鉴定猪丹毒丝菌GAPDH的表位获得一种高度特异性氨基酸序列，从而建立能够特异性检测猪丹毒丝菌GAPDH抗原免疫后血清抗体水平的检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：提供了一种用于血清抗体检测的猪丹毒丝菌GAPDH分子抗原多肽序列，由该序列构成多肽具有高度特异特异性的特征，仅能与猪丹毒丝菌GAPDH高免血清或猪丹毒丝菌高免血清抗体反应，而不能与其他养殖场常见细菌高免血清发生反应。
优选的，所述GAPDH分子抗原多肽包含至少一个猪丹毒丝菌GAPDH表位ERepitope1或ERepitope2，其中GAPDH表位ERepitope1对应ERG-1多肽，其氨基酸序列为QLVSTDIIGMSY；ERepitope2对应的合成多肽为ERG-2，其氨基酸序列为：ERG-2A：HAYTNDQNTLDGPHAKGDLRRGRAA；或者ERG-2B：DQNTLDGPHAKGDLRRGRAAAQSII；或者ERG-2C：DGPHAKGDLRRGRAAAQSIIPNSTG；或者ERG-2D：
KGDLRRGRAAAQSIIPNSTGA。
上述血清抗体检测猪丹毒丝菌的GAPDH分子抗原多肽可在特异性检测猪丹毒丝菌方面得到应用。
上述血清抗体检测猪丹毒丝菌的GAPDH分子抗原多肽可在评估GAPDH抗原免疫效果方面进行应用。
上述用于血清抗体检测猪丹毒丝菌的GAPDH分子抗原多肽的制备方法，制备步骤为：使用固相肽合成法合成ERG-1多肽或ERG-2，即依次向树脂中添加氨基酸以构建肽链；当合成完成后，首先去保护N-端的Fmoc基团，然后去保护侧链保护基团，最后将多肽从树脂上切割下来；粗肽液样品溶解后，注入高效液相色谱仪，对色谱中出现的每个部分进行分子量和纯度测试，以确认目标多肽含量。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，尽管目前现有技术可以使用猪丹毒丝菌GAPDH分子重组蛋白为抗原检测GAPDH分子的免疫后抗体产生情况，但是由于不同细菌中都有GAPDH分子，不同细菌GAPDH的抗体可能具有交叉反应性，目前技术所采用技术手段所建立的检测方法的特异性较差，难以有效检测猪丹毒丝菌GAPDH的免疫效果。本发明通过解析GAPDH抗原表位找到了能与猪丹毒丝菌GAPDH抗体发生特异性反应的一段多肽多肽序列，该多肽与猪场常见细菌康复血清均不发生反应，具有高度的特异性，可以用于建立评估猪丹毒丝菌GAPDH免疫后血清抗体水平的检测方法。
附图说明
图1为猪丹毒丝菌GAPDH各氨基酸残基构成表位能力及线性B细胞表位预测结果；使用在线软件Bepipred-2.0（http://www.detaibio.com/tools/epitope-prediction- vr.html），所分析的序列为SE38株的GAPDH序列
图2 为所预测到的表位在猪丹毒丝菌GAPDH分子上的位置； 图中氨基酸序列为巴氏杆菌C51-17株GAPDH的一级结构，本研究所预测到的抗原表位已经用下划线标出
图3为间接ELISA法检测多肽与高免血清之间反应的结果；
图4 为间接ELISA法检测多肽与猪场常见细菌免疫血清之间的反应情况。A，包被抗原为猪丹毒丝菌GAPDH全长分子的重组蛋白；B，包被抗原为ERG-1多肽。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1猪丹毒丝菌GAPDH抗原表位预测
（1）基因序列来源本发明首先分析了已经完成基因组测序的猪丹毒丝菌的基因组数据中的猪丹毒丝菌GAPDH氨基酸序列：SE38 (NZ_CP011861.1)、G4T10 ( NZ_CP011860.1)、SY1027 (NC_021354.1)、ZJ (NZ_CP041995.1)、ML10 1 (NZ_CP029804.1)、WH13013 (NZ_CP017116.1)、GXBY-1 (NZ_CP014861.1)、Fujisawa (NC_015601.1)、NCTC8163 (NZ_LR134439.1)、KC-Sb-R1 (NZ_CP033601.1)。所有序列从自美国国立生物技术信息中心数据库NCBI-GenBank 公共数据库中获得。
（2）生物材料及主要试剂所有高免血清均在以前的实验中已经制备并保存。ELISA板购自美国Costar公司，HRP鼠二抗购自Biosharp公司，TMB单组分显色液购自湖州英创生物科技有限公司。
（3）不同菌株GAPDH氨基酸序列的比较 使用在线软件Clustal Omega（http://www.clustal.org/omega/）完成多序列比对，比较（1）中不同猪丹毒丝菌GAPDH氨基酸序之间的相似性。通过多序列比较发现猪丹毒丝菌SE38、G4T10、SY1027、 ZJ、ML10 1、WH13013、GXBY-1、Fujisawa、NCTC8163、KC-Sb-R1的GAPDH氨基酸序列完全相同（Identity=100%，故未展示多序列比对结果），显示出猪丹毒丝菌GAPDH具有高度保守的特点。
（4）猪丹毒丝菌GAPDH表位预测 使用在线软件Bepipred-2.0（http://www.detaibio.com/tools/epitope-prediction-vr.html）分析猪丹毒丝菌GAPDH分子（SE38株）上各个氨基酸残基构成表位的能力。以软件默认的0.5为阈值，高于此阈值且有较长连续序列的一段多肽被预测为GAPDH分子的线性B细胞表位。所预测的猪丹毒丝菌GAPDH线性B细胞表位的分布状况如图1所示。有多段连续序列高于软件默认的阈值0.5，后续实验选择了最长的三个片段（分别记为ERepitope1、ERepitope2、ERepitope3，表1，图2）作为预测到的线性B细胞表位进行后续研究。
图1表位预测结果与对应多肽合成情况
实施例2 猪丹毒丝菌GAPDH表位鉴定
（1）表位多肽的化学合成 针对Bepipred-2.0所预测到的线性B细胞表位，通过南京金斯瑞生物科技股份有限公司化学合成对应序列的线性多肽。合成过程简述如下，使用固相肽合成法（SPPS）合成多肽，即依次向树脂中添加氨基酸以构建肽链。当合成完成后，首先去保护N-端的Fmoc基团，然后去保护侧链保护基团，最后将多肽从树脂上切割下来。粗肽液样品溶解后，注入高效液相色谱（HPLC）仪，对色谱中出现的每个部分进行分子量和纯度测试，以确认目标多肽含量。以人工化学合成方式成功地获取了所预测表位对应的多肽（分别标记为ERG-1、ERG-2（A-D）、ERG-3）（表1）。由于抗原表位ERepitope2长度超过25个氨基酸残基，常规合成难度较大，所以合成能够覆盖对应表位的重叠多肽以完成后续实验。
（2）表位与GAPDH高免血清的反应使用间接ELISA法鉴定多肽与血清的反应性，简要叙述如下。以上述多肽分别包被ELISA板（10μg/孔，对照组不包被任何抗原），37℃孵育2h。以PBST洗涤5次以后，使用5%的脱脂乳于37℃下封闭1 h。接下来孵育1/200稀释的猪丹毒丝菌SE38株GAPDH高免血清，37℃下1 h。以PBST洗涤5遍以后，孵育偶联HRP的羊抗鼠二抗，37℃下孵育30 min。经过5遍洗涤以后加入100μl的TMB单组分显色液，反应10 min后加入50μl终止液（2M硫酸）。最后在酶标仪上读取450nm的吸光度。
猪丹毒丝菌GAPDH的两个表位ERepitope1和ERepitope2对应的合成多肽（ERG-1、ERG-2（A-D））均能够与猪丹毒丝菌GAPDH高免血清发生明显的反应(P<0.05)，但是ERepitope3对应的合成多肽（ERG-3）不能与猪丹毒丝菌GAPDH高免血清发生反应(P>0.05)。该结果证实所预测到的ERepitope1和ERepitope2是猪丹毒丝菌GAPDH的抗原表位，尤其是ERepitope1（ERG-1多肽，QLVSTDIIGMSY）反应最强烈，适于用于后续实验。
实施例3表位多肽与猪场常见细菌免疫血清的反应情况
以猪丹毒丝菌GAPDH全长分子的重组蛋白或多肽ERG-1包被ELISA板（10μg/孔，对照组不包被任何抗原），37℃孵育2 h。以PBST洗涤5次以后，使用5%的脱脂乳于37℃下封闭1h。接下来孵育1/500稀释的猪源细菌高免血清（所免疫菌株分别为猪丹毒丝菌SE38株、胸膜肺炎放线杆菌JL03株、多杀性巴氏杆菌E0630株、大肠杆菌PCN033株、副猪嗜血杆菌SH0165株、猪霍乱沙门氏菌C500株、枯草芽孢杆菌BS168株、乳酸乳球菌MG1363株、马链球菌兽疫亚种ST171株、猪链球菌R61株），37℃下孵育1 h。以PBST洗涤5遍以后，孵育偶联HRP的羊抗鼠二抗，37℃下孵育30 min。经过5遍洗涤以后加入100μl的TMB单组分显色液，反应10 min后加入50 μl终止液（2M硫酸）。最后在酶标仪上读取450nm的吸光度。实验结果如图4所示，ELISA检测中包被抗原是猪丹毒丝菌GAPDH重组蛋白时，其他细菌的抗血清也会发生不同程度的交叉反应结果（图4A），但是当包被抗原是ERG1多肽时其他细菌的抗血清则不会出现明显的交叉反应（图4B）。这一结果显示出ERG1具有高度特异性的特点，可以用于猪丹毒丝菌GAPDH免疫后的抗体水平评估，甚至也可以用于猪丹毒感染的鉴定。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
