一种靶向kgf启动子的间充质干细胞治疗急性肺损伤筛选模型
技术领域
本发明涉及用于潜在药物筛选的细胞模型和潜在药物的筛选方法，具体涉及一种靶向KGF启动子的间充质干细胞治疗急性肺损伤筛选模型。
背景技术
急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征（Acuterespiratory distress syndrome，ARDS）是一种危及生命的疾病并且在患者中死亡率极高。ALI 和ADRS的特征主要是肺泡-毛细血管膜屏障损伤，白细胞积聚，肺水肿，炎症细胞渗出以及肺泡出血，从而导致免疫系统和肺泡毛细血管之间产生复杂关系，导致急性促炎反应。
间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是一种具有自我更新，分化能力的细胞。越来越多的研究发现，MSCs可以分泌可溶性因子，如生长因子、抗炎性因子和抗微生物肽等，从而可以稳定肺部微血管屏障，增强肺泡液体的清除，并可以降低感染。并且MSCs来源广泛，可以从多种组织中分离，如骨髓，脂肪，胎盘等。根据临床前的研究，不同来源的MSCs有着不同的免疫和生物功能。人胎盘绒毛膜来源的MSCs（human chorionicvillus-derived mesenchymal stem cells，hCMSCs）属于胎盘来源的MSCs，被认为是MSCs的替代来源。由于hCMSCs可以分化成三个胚层并且容易获得，因此与其他来源的MSCs相比具有更好的免疫调节功能。
角质细胞形成因子（Keratinocyte Growth Factor，KGF）是成纤维细胞生长因子家族成员之一。KGF被认为是MSCs最重要的旁分泌可溶性因子之一，可以在体内和体外刺激II型肺上皮细胞的增殖，促进II型上皮细胞的修复，从而增强机体对肺损伤的抵抗。KGF可以通过促进表面活性物质合成，改善水肿清除率。另有研究发现，KGF可以减少肺损伤时肺内羟基脯氨酸积聚，抑制胶原mRNA的表达，从而阻止肺纤维化。
高通量药物筛选技术已经成为目前药物筛选领域研究的重要课题，针对靶标的药物研究过程是发现先导化合物的关键，在药物研发过程中起到重要作用。中国专利CN110452880A公开了一种急性肺损伤细胞模型的制备方法及其应用，具体公开了1）将A549细胞置于诱导培养基中进行诱导培养，然后弃去培养基，消化收获细胞；2)将收获的A549细胞用培养基悬浮，置于培养皿中，添加炎性物质刺激激发炎症反应，继续培养12-48小时后，即可用于急性肺损伤的药物筛选。而目前未见如本申请所述的用于急性肺损伤药物筛选的细胞模型。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足，提供了一种用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物的靶向KGF启动子的间充质干细胞、其制备方法和用途，以及一种筛选治疗急性肺损伤潜在药物的方法。
在第一方面，所提供的用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物的靶向KGF启动子的间充质干细胞，其制备方法为：
1）构建含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体；
2）利用步骤1）所述的含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体，制备含有KGF基因启动子的慢病毒溶液，并进一步感染间充质干细胞，筛选稳转株。
较佳地，所述含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体中插入的KGF基因启动子的序列如SEQ ID NO:3所示。
较佳地，所述含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建方法为：将KGF基因启动子序列插入到含有荧光素酶报告基因的载体CV123-Luc的PacI 和 BamHI位点之间。
较佳地，所述间充质干细胞是人胎盘绒毛膜来源的间充质干细胞。
在第二方面，所提供的用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物的靶向KGF启动子的间充质干细胞的制备方法，其包括以下步骤：
1）构建含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体；
2）利用步骤1）所述的含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体，制备含有KGF基因启动子的慢病毒溶液，并进一步感染间充质干细胞，筛选稳转株。
较佳地，所述含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体中插入的KGF基因启动子的序列如SEQ ID NO:3所示。
较佳地，所述含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建方法为：将KGF基因启动子序列插入到含有荧光素酶报告基因的载体CV123-Luc的PacI 和 BamHI位点之间。
较佳地，所述间充质干细胞是人胎盘绒毛膜来源的间充质干细胞。
在第三方面，所提供的用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物的靶向KGF启动子的间充质干细胞的用途，是用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物。
在第四方面，所提供的筛选治疗急性肺损伤潜在药物的方法，是使用待试物质刺激所述的用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物的靶向KGF启动子的间充质干细胞，作用一段时间后，利用并根据荧光素酶报告基因检测荧光强度，来反映KGF基因启动子的活性，从而获得靶向KGF基因启动子促荧光素酶报告基因高效表达的化合物，即得治疗急性肺损伤的潜在药物。
本发明相比于现有技术，其有益效果在于：
1、本发明药物筛选模型的建立方法不同于以往，以往通常是以293 T 等细胞为基础导入靶标基因，或直接以疾病的代表性细胞为模型。而本发明首次使用对疾病具有治疗作用的间充质干细胞为模型，以编码间充质干细胞分泌的可溶性因子的KGF基因的启动子为靶点，筛选促进间充质干细胞分泌可溶性因子KGF的潜在药物，为使用药物与间充质干细胞联合治疗急性肺损伤，增强疗效，奠定了基础。本发明的模型可以从海量化合物库中高通量的筛查出具有靶向KGF启动子的化合物，对急性肺损伤疾病治疗药物筛选有良好的应用前景。
2、利拉鲁肽是GLP-1的类似物，在我们之前的研究中发现，利拉鲁肽具有抑制炎症，促进间充质干细胞KGF-2，Ang-1及SPC表达，从而减轻急性肺损伤的作用。地塞米松是临床上常用的一种糖皮质激素类药物用于治疗ALI早期炎症放大反应，并取得一定的效果，并且之前有研究发现地塞米松也可以促进KGF的表达。本发明应用利拉鲁肽和地塞米松作为药物来验证筛选平台，结果表明该药物筛选平台可筛选出引起KGF表达增高的药物。这表明本发明制备的间充质干细胞筛选模型为药物与KGF启动子的作用提供了良好环境，且本发明所选择的KGF基因启动子片段以及所构建的质粒载体是合适的，能够与引起KGF表达增高的药物有效结合，避免漏筛。
附图说明
图1：CV-123-KGF-promoter-Luc重组质粒的构建。
图2：利拉鲁肽靶向KGF启动子对荧光素酶报告基因的表达强度作用图。
图3：地塞米松靶向KGF启动子对荧光素酶报告基因的表达强度作用图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
实施例1
1含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建
1.1引物设计
利用NCBI Gene中的KGF基因启动子区序列约3000bp，应用Primer Primer 5.0引物设计软件，设计KGF启动子的引物KGF-F和KGF-R。
KGF-F：AGATCCAGTTTGGTTAATTAAATCCTATAGATTTATTTTCGTAGTATA
AAATGAC（SEQ ID NO:1）
KGF-R：CGACCGGTACCCGGGGATCCTAGCCAGTGAGCTGTTAGTTGAATAC（SEQ ID NO:2）
1.2 KGF基因启动子序列的获得
利用上述KGF启动子的引物KGF-F和KGF-R，以人工合成的启动子区序列KGF（委托上海捷瑞生物工程有限公司合成）为模板进行PCR，扩增得到目的片段KGF的启动子序列，并利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，获得两端含有PacI 和 BamHI酶切位点目的产物约3000bp。
1.3携带KGF启动子的荧光素酶报告基因的重组质粒的构建
将1.2获得的启动子序列KGF经PacI 和 BamHI双酶切处理后，纯化回收，并将其与含有荧光素酶报告基因的载体CV123-Luc（含有双荧光素酶报告基因的CV123载体(购于吉凯基因)经由PacI和BamHI双酶切处理后，纯化回收得CV123-Luc）进行连接，连接反应液转化进入大肠杆菌DH5α感受态中，在LB固体培养基上，37℃倒置培养16-20h，挑取氨苄青霉素抗性阳性单克隆，提取质粒DNA，利用菌落PCR、酶切等技术初步鉴定阳性克隆，获得重组质粒，命名为CV-123-KGF-promoter-Luc。重组质粒的构建见图1。质粒中插入的KGF启动子序列如SEQ ID NO:3所示。
2稳定表达含有KGF基因启动子的hCMSCs的筛选
2.1含有KGF基因启动子的慢病毒溶液的制备
在转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T 细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度约 5×10 6 细胞/15 ml，重新接种于 10 cm 细胞培养皿，在37 ℃、5% CO2 培养箱内培养。24 h 待细胞密度达 70% - 80%时即可用于转染。转染前2h 更换为无血清培养基。向一灭菌离心管中加入所制备的GV-123-KGF-promoter-Luc 载体质粒20μg、pHelper1.0载体质粒（Biovector NTCC Inc. USA, Biovector510383） 15μg、pHelper2.0 载体质粒（Biovector NTCC Inc. USA）10μg，加入病毒感染增强液，调整总体积为 1 ml，在室温下温育 15 min；混合液缓慢滴加至 293T 细胞的培养液中，混匀，于 37℃、5% CO2 细胞培养箱中培养；培养 6 h 后弃去含有转染混和物的培养基，加入 10 ml 的 PBS 液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含 10%血清的细胞培养基 20ml，于37℃、含5% CO2 培养箱内继续培养 48-72 h。
2.2含有KGF基因启动子的慢病毒溶液的浓缩与纯化
根据细胞状态，收集转染后48 h（转染即可为 0 h 计起）的 293T 细胞上清液；于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；以 0.45μm 滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至 Beckman 超速离心机内，设置离心参数为 25000 rpm，离心时间为 2 h，离心温度控制在 4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000 rpm，离心 5 min 后，取上清分装。
2.3含有KGF基因启动子的慢病毒溶液的滴度检验
测定前一天，使用293T贴壁细胞铺板，96孔板，每孔4×104个细胞，体积100μl；根据病毒的预期滴度，准备8个无菌的EP管，在每管中加入90μl 的无血清培养基；取待测定的病毒原液10μl 加入到第一个管中，混匀后，取10 μl 加入到第二个管中，继续相同的操作直到最后一管；选取所需的细胞孔，弃去90μl 培养基，加入90μl稀释好的病毒溶液，培养箱培养；24 h 后，加入完全培养基100μl。感染后 72 h 加入抗性药物嘌呤霉素，维持药物浓度5μg/ml。继续培养1天，观察细胞生长状况。通过感染后的活细胞数量来计算病毒滴度。病毒滴度=活细胞数/病毒原液量，即所测得病毒滴度为2E+8TU/ml。
2.4稳定表达KGF启动子的hCMSCs的筛选
用完全培养基制备密度为3-5×104个/ml的人胎盘绒毛膜来源的间充质干细胞的细胞悬液，500μl接种于24孔板中，37℃培养于16-24h，至细胞汇合度为20%-30%。将感染试剂混匀到培养基中，随后按照病毒滴度加入慢病毒。37℃培养12-16h，更换为完全培养基，继续培养。感染48-72h后，将细胞继续培养于含嘌呤霉素2μg/ml的培养基中，每2-3天更换一次含嘌呤霉素的培养基，直至未感染的对照组细胞被嘌呤霉素全部杀死，而感染病毒组无细胞出现死亡。将嘌呤霉素浓度减至维持浓度的1/2-1/4，继续对感染后的细胞进行筛选和扩增，获得稳定表达KGF基因启动子的hCMSCs稳转株。
3药物筛选的应用
将2筛选出的表达KGF启动子的hCMSCs稳转株按照每孔2×104个细胞100μl铺于96孔板，加入阳性对照药物利拉鲁肽（100nM，购自麦克林公司）和地塞米松（10nM，购自Sigma公司），以加入含有DMSO的培养基作为空白对照，每组设置5个复孔，作用72h后，加入100μlDual-Lumi™萤火虫萤光素酶检测试剂（Dual-Lumi™ 双萤光素酶报告基因检测试剂盒，购自碧云天公司），混匀，室温静置10min，使用多功能酶标仪检测荧光强度。随后再加入100μlDual-Lumi™海肾萤光素酶检测工作液（Dual-Lumi™ 双萤光素酶报告基因检测试剂盒，购自碧云天公司），混匀，室温孵育10min，使用多功能酶标仪检测荧光强度。
按照公式：目的基因激活程度=萤火虫萤光素酶报告基因测得的RLU/海肾素萤光素酶报告基因测度的RLU 计算利拉鲁肽（见图2）和地塞米松（见图3）靶向KGF促进萤光素酶表达的激活程度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院
<120> 一种靶向KGF启动子的间充质干细胞治疗急性肺损伤筛选模型
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
agatccagtt tggttaatta aatcctatag atttattttc gtagtataaa atgac 55
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
cgaccggtac ccggggatcc tagccagtga gctgttagtt gaatac 46
<210> 3
<211> 3160
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
gaattgtggg cccatcctga attaataatt ctccaataaa aatgataatc aaagaattta 60
aaccattgat acagttccct tgttgatatt aatctgttca ttaatattac ttggatcata 120
tttccaaatt acagagtgta atagcatcta atgcactttc atagatcaca attttattct 180
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cccctcccta ttcttaatct ctcattgcaa acagaagtca aatagcaaac agcgtcacag 2760
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ctctttctta aatcaatcta caattcacag ataggaagag gtcaatgacc taggagtaac 2940
aatcaactca agattcattt tcattatgtt attcatgaac acccggagca ctacactata 3000
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gctacaaatg tgaactgttc cagccctgag cgacacacaa 3160
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