一种人源诱导肝向分化干细胞的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物制药
技术领域
，具体涉及一种人源诱导肝向分化干细胞的制备方法及其应用。背景技术
各种原因导致的急慢性肝病目前仍然是影响人们健康的主要因素之一，包括各种病毒性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎和遗传性肝病等。随着近年来诊断技术水平和对疾病认识的提高，越来越多的自身免疫性肝炎和遗传性肝病等肝病也不再罕见。与此同时，随着人们生活水平的提高，酒精和糖的摄入量呈明显升高趋势，酒精性肝病/非酒精性肝病/脂肪肝已成为不可忽视的公共卫生健康问题。这些肝脏疾病长期迁延不愈可发展成肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。虽然近年来针对这些肝病的诊断与治疗手段有了很大的进步，但是对于终末期肝病-肝硬化仍然缺乏有效的治疗手段，肝脏移植是目前临床上唯一的治疗手段，但是缺乏足够及合适的同种异体供体肝脏是晚期肝病患者需要移植时长期面临的问题。
细胞移植(cell transplantation)是近年来发展起来的热门技术，特别是干细胞(stem cell)移植由于干细胞来源广泛，可体外扩增和工业化生产等优点被寄予很大的希望，但是干细胞体外肝细胞定向分化(hepatic-specified differentiation)仍然存在着分化周期长，费用较高，分化成熟度不够并且再生能力不强等缺点需要克服和解决。现在全世界的科学家们试图利用细胞移植技术来治疗和预防各种肝脏疾病，如何提供更好的肝向分化干细胞来用于细胞移植治疗各种肝病来满足临床的需要，是亟待要解决的技术问题。
发明内容
为此，本发明提供一种人源诱导肝向分化干细胞的制备方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种人源诱导肝向分化干细胞的制备方法，所述方法包括将人iPS干细胞用mTeSRTM1干细胞培养液进行培养，待人iPS干细胞生长明显时，向所述mTeSRTM1干细胞培养液中加入激活素A处理，所述人iPS干细胞进行内胚层的诱导分化，得到内胚层细胞；
将所述内胚层细胞在含有骨形成蛋白4和成纤维细胞生长因子2的RPMI+B27培养基中培养，使得所述内胚层细胞定向分化，得到肝向分化干细胞。
本发明的一个实施例中，所述人iPS干细胞的培养环境为4％氧气，5％二氧化碳。
本发明的一个实施例中，所述内胚层诱导分化的环境条件为20％氧气，37℃，培养5天。
本发明的一个实施例中，所述内胚层细胞定向分化的条件为4％氧气，37℃，培养5天。
本发明的一个实施例中，所述骨形成蛋白4的浓度为20ng/mL。
本发明的一个实施例中，所述成纤维细胞生长因子2的浓度为10ng/mL。
上述所述方法制备的人源诱导肝向分化干细胞在治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症和/或其它肝病的药物制剂中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明具有如下优点：
试验证明：在本发明方法制备的人源诱导肝向分化干细胞，并通过脾髓注射法将其移植到小鼠的肝脏中再生，不会产生不必要的肝脏肿瘤，本发明中发明制备的肝向分化干细胞(hepatic-specified stem cell)具有减少分化时间，减少费用，增强肝脏体内再生能力和成熟度等优点，该技术在临床应用具有广阔的前景。
本发明方法制备的人源诱导多能干细胞衍生的肝细胞样细胞可以是原代肝细胞的很有前途的替代品，其具有在体外增殖生产的优势，而且没有像胚胎干细胞那样的受到过多伦理道德的约束。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例提供的人源诱导肝向分化干细胞的制备流程图；
图2为本发明实施例提供的人源诱导肝向分化干细胞在转基因小鼠肝脏内的增生。移植细胞在转基因小鼠肝脏内的增生情况通过人血清白蛋白和α-1抗胰蛋白酶的免疫荧光染色进行评估，刻条＝100μm。20×显微镜放大率；
图3为本发明实施例提供的小鼠血中人血清白蛋白含量(n＝6).所有值均以平均值+SEM表示.*P<0.05；
图4为本发明实施例提供转基因小鼠肝脏内人血清白蛋白基因DNA的含量百分比(n＝6).所有值均以平均值+SEM表示*P<0.05。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，人iPS干细胞(DYR0100)购买自美国ATCC，mTeSRTM1购自Stemcell,Vancouver,Canada。
实施例1、人源诱导肝向分化干细胞的制备方法
如图1所示，本实施例提供一种人诱导肝向分化干细胞的制备方法，其包括以下步骤：
步骤一、干细胞培养
细胞培养板的包被：用移液管吸取6ml基础培养基(DMEM/F-12)于15ml falcon试管中，从冰箱中取出分装好的0.25ml matrigel(Corning,NY,USA)，将matrigel混匀在0.5ml基础培养液中，溶解后与剩余的基础培养液混合；在6孔板中每孔板加入1ml混合基础培养液，并旋转六孔板，使凝胶液均匀地覆盖在板上，放置在超净台1小时。吸去凝胶液，用DMEM/F-12冲洗一次，得到包被的细胞培养板。
将1百万人源iPS干细胞加入到2ml mTeSRTM1培养液中，混匀。然后在matrigel包被的6孔细胞培养板中，进行培养，将细胞培养板置于4％氧气，5％二氧化碳，37℃的培养箱中，隔天换一次培养液，当干细胞克隆生长超过50％孔面积的情况下，进行传代培养。
步骤二、干细胞肝向分化
将100ng/mL激活素A(actvin A)(R&D systems，Minneapolis，MN，USA)直接添加到2ml DMEM/F-12细胞培养液中，替换步骤一中的mTeSRTM1培养液来处理内胚层细胞，并在20％氧气下，37℃启动人源iPS干细胞的肝向分化，得到内胚层细胞，期间每隔一天换相同新鲜培养液一次。
培养5天后，将培养液换成含有20ng/mL BMP-4(Peprotech，Rocky Hill，NJ，USA)和10ng/mL FGF-2(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的RPMI+B27培养液来分化细胞，在4％氧气下，37℃，连续培养5天，期间每隔一天换相同新鲜培养液一次。
最后，使用Accutase(Gibco，Grand Island，NY，USA)消化并收集肝向分化干细胞，混匀，在显微镜下进行计数，每100万细胞用于一个小鼠的细胞移植试验。其中，Accutase细胞分离溶液是包含蛋白水解酶和胶原酶活性的一种细胞消化液，用于从常规粘附培养器皿中消化细胞，从而细胞脱落成单个细胞进入培养液中。
多余的肝向分化干细胞可以加入细胞冻存液(10％DMSO,20％FCS(小牛血清),70％DMEM)于液氮中长期超低温保存，100万细胞加1ml细胞冻存液。
实施例2、人源诱导肝向分化干细胞的移植
本实施例中，选择35只雄性AATD转基因小鼠(6-8周龄)进行细胞移植试验。
其中，实验组通过脾髓内注射法将1百万实施例1制备的肝向分化干细胞移植到转基因小鼠的肝脏中。其中，AATD转基因小鼠由赛业(苏州)生物科技公司协助制作完成。
空白对照注射生理盐水，移植前一周，给小鼠提供含1μg/g/天他克莫司FK506(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)的饮用水以抗排异反应。
试验结果：
如图2所示，移植后1个月，转基因小鼠肝脏病理切片人血清白蛋白(human serumalbumin，HSA)免疫荧光染色显示50-100成簇的人肝细胞(人血清白蛋白染色阳性)。约占肝细胞总量的5-10％。移植后3个月和6个月，移植的人肝细胞增殖逐渐增加，分别达到宿主肝脏的10-15％和15-20％。在AATD转基因小鼠模型中，肝脏细胞以含有变异的人α-1抗胰蛋白酶(α-1antitrypsin,AAT)形成的球形小体为特征(Diastase/PAS染色红色)。供体移植细胞(HSA免疫染色为绿色)中没有红色的球形小体(Diastase/PAS染色阴性)，因为移植的细胞表达和分泌正常水平的人AAT。
如图3所示，分别于移植后1、3、6个月测定小鼠血清中HSA的含量，结果分别为18.11±1.47、82.00±5.85、464.22±29.90ng/mL，细胞移植后3个月和6个月的小鼠血清中人HSA含量明显高于细胞移植后1个月(P<0.05)。
如图4所示，用人HSA基因的含量来估计移植细胞在转基因小鼠肝脏内的再生程度。结果表明，供体细胞在转基因小鼠肝脏中植入后随时间的推移而自发增殖，在细胞移植后1个月、3个月和6个月后测量小鼠肝脏中人HSA DNA含量，结果分别为总DNA的6.74±0.71％、10.58±0.29％和17.19±0.49％。细胞移植后3个月和6个月人HSA基因DNA含量明显高于细胞移植后1个月的含量(P<0.05)。
本实施例的实验证明，实施例1制备的人源iPS干细胞衍生的肝向定向分化干细胞可以成功地移植到异种小鼠肝脏中并在小鼠肝脏中再生，而不会产生不必要的肝脏肿瘤，并且随着时间的推移逐渐增多。因此，本实施例1制备证明移植细胞能够在小鼠肝脏体内成熟、增殖与再生，并且合成和分泌人HSA到小鼠血液中。
α-1抗胰蛋白酶缺乏症是危及生命的肝病之一，到了晚期往往出现肝硬化情况，因此需要肝脏移植治疗。研究资料表明用AATD转基因小鼠模型已经成功地进行了一些肝细胞移植实验，证明了野生型小鼠肝细胞在转基因小鼠的肝脏中具有竞争性再生能力，野生肝细胞甚至可以99％代替受体的受损肝细胞。本实施例研究结果表明，体外产生的人干细胞来源的肝向定向分化干细胞可以成功地替代人原代肝细胞用于细胞移植治疗，有希望作为新的细胞来源用于治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症或者其它肝脏疾病，同时这个分化方法节省时间和成本，具有很好的临床应用前景。
虽然上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
