具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种小规模化生产富硒荷叶离褶伞菌丝体的方法，包括以下步骤：

S1、制备荷叶离褶伞种子培养液：在250mL三角瓶中，加入100mL的加富PDA培养基，接入活化的荷叶离褶伞菌种，摇床培养5d，得到荷叶离褶伞种子培养液，置于4℃冰箱备用；

S2、制备蛋白水解液：称取黄豆100g，浸泡过夜后打浆，将其煮沸并降温至40℃，再加入5％的蛋白酶，并在40℃恒温水浴锅中水浴5h，制得蛋白水解液；

S3、制备玉米淀粉水解液：称取玉米面600g，并加入65℃热水6000g，再加入5％的淀粉酶，置于65℃恒温水浴锅中混合至遇碘液无色为止，得到玉米淀粉水解液；

S4、混合制成发酵培养基，将步骤S2所述蛋白水解液和步骤S3所述玉米淀粉水解液用300目的筛过滤后混合，再加入葡萄糖200g，并在121℃下灭菌40min，冷却后得到发酵培养基；

S5、接种荷叶离褶伞种子：在所述发酵培养基中接种步骤S1所述荷叶离褶伞种子培养液，接种量为8.5％；通入无菌空气，并在罐内压强为0.02MPa的条件下进行无菌培养；

S6、无菌培养第3d，在发酵培养基中加入无菌的Na₂SeO₃溶液，使1mL发酵培养基中含有4μg Na₂SeO₃，再继续发酵5d；

S7、发酵结束后，将发酵液经300目滤网过滤，蒸馏水反复洗涤菌球后，置于冷冻干燥机中在-25℃进行干燥，称重即得富硒荷叶离褶伞菌丝体菌丝体。

经检测，发酵结束后本发明菌丝体干重量和富硒量达到最大值分别为8.154g/L和234.785μg/100mL，空白对照组(未加入Na₂SeO₃)菌丝体干重仅为4.758g/L。本发明菌丝体中多糖的含量为11.6mg/g，蛋白的提取量为13.5mg。

性能实验(以下实验仅是调整实施例1中加硒时间，其他参数均未作出调整)

1、本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体进行体外吸附胆酸盐试验，具体实验结果如表1所示。

表1

注：与空白组对照，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

从表1中可以看出，在第三天加入富硒所获得的菌丝体体外吸附胆酸盐的能力最优，其降胆酸盐能力较好。

2、本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体进行体外吸附胆固醇试验，实验结果如表2所示。

表2

注：与空白组对照，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

由表2可知，在第3d加硒所获得的菌丝体对胆固醇的吸附量最高，其降胆固醇能力最强。

3、菌丝体悬液对α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究

本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体悬液，并利用上述悬液对α-葡萄糖苷酶的抑制活性的测定，如图1所示。

从图1中可以看出，富硒荷叶离褶伞的第三天的悬液对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高为65.03％，并且此标准偏差是最小的。说明富硒荷叶离褶伞的第三天的菌悬液相比与未富硒荷叶离褶伞的菌悬液和其他几天的富硒荷叶离褶伞的菌悬液降血糖效果要好。在发酵第三天后加硒，菌丝体对α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈下降趋势。

4、菌丝体多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性的研究

本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体，并从菌丝体中提取多糖，再利用菌丝体多糖(浓度为0.5mg/mL)对α-葡萄糖苷酶的抑制活性的测定，如图2所示。

从图2中可以看出，第三天加硒的荷叶离褶伞菌体提取的多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高为69.97％。根据青砖茶粗多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性进行(舒婷2019)比较，青砖茶粗多糖浓度在3.20mg/mL时对α-葡萄糖苷酶抑制率为(57.59±0.54)％。与其相比富硒荷叶离褶伞菌丝体提取的多糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性更好。并且富硒荷叶离褶伞菌丝体提取的多糖比未富硒荷叶离褶伞菌丝体提取的多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率都要高，说明将富硒后的菌丝体得到硒多糖拥有更好的降糖效果。但在发酵第三天后加硒，菌丝体的多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈下降趋势。

5、菌丝体蛋白对α-葡萄糖苷酶的抑制活性的研究

本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体，从其中提取菌丝体蛋白，并利用菌丝体蛋白(浓度为1mg/mL)对α-葡萄糖苷酶的抑制活性的测定，如图3所示。

从图3中可以看出，发酵第三天加硒菌丝体所提取的蛋白对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高为65.79％。

6、菌丝体中可溶性多糖对羟自由基清除能力的研究

本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体，从菌丝体中提取可溶性多糖，利用不同浓度的可溶性多糖对羟自由基清除能力进行检测，如图4所示(图4中样1为第2d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样2为第3d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样3为第4d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样4为第5d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖)。

从图4中可以看出，不同发酵时间加硒后，发酵得到的菌丝体中可溶性多糖对羟自由基有一定的清除能力，且随着浓度不断增加，清除率也逐渐升高，表现出明显的剂量—效应关系。

在可溶性多糖浓度为32μg/mL的情况下，样1中富硒可溶性多糖对羟自由基的清除率最大，达到35.37％；样4最小，为26.11％，说明在发酵过程中加入硒的时间与其清除羟自由基的能力有关，随着加入时间的延迟，清除能力减弱。未富硒空白菌丝体中可溶性多糖的清除率为19.28％，与富硒组相比，清除力较弱。这与齐睿婷在乳酸乳球菌富硒及其硒多糖抗氧化活性的研究类似，其中提到：富硒多糖对羟自由基的清除能力随着浓度的增加而增加，普遍高于未富硒多糖。

7、菌丝体中可溶性多糖对DPPH自由基清除能力的研究

本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体，从菌丝体中提取可溶性多糖，利用不同浓度的可溶性多糖对DPPH自由基清除能力进行检测，如图5所示(图5中样1为第2d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样2为第3d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样3为第4d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样4为第5d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖)。

从图5中可以看出，不同发酵时间加硒后，发酵得到的菌丝体中可溶性多糖对DPPH自由基有一定的清除能力，且随着浓度不断增加，清除率也逐渐升高，表现出明显的剂量—效应关系。

在可溶性多糖浓度为32μg/mL的情况下，样1中富硒可溶性多糖对DPPH自由基的清除率最大，达到52.29％；样4最小为33.95％；说明在发酵过程中加入硒的时间与其对DPPH自由基的清除能力有关，随着加入时间的延迟，清除能力减弱。未富硒空白菌丝体中可溶性多糖的清除率为23.73％，与富硒组相比，清除力较弱。样2在可溶性多糖浓度为25.6μg/mL时，清除率大于样1，这与徐春兰等对Enterobacter Cloacae Z0206细菌胞外富硒多糖的抗氧化性活性的研究一致，其指出Enterobacter Cloacae Z0206细菌胞外富硒多糖在一定浓度范围内对DPPH自由基具有一定的清除活性。

8、菌丝体中可溶性多糖对ABTS自由基清除能力的研究

本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体，从菌丝体中提取可溶性多糖，利用不同浓度的可溶性多糖对ABTS自由基清除能力进行检测，如图6所示(图6中样1为第2d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样2为第3d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样3为第4d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样4为第5d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖)。

从图6中可以看出，不同发酵时间加硒后，发酵得到的菌丝体中可溶性多糖对ABTS自由基有一定的清除能力，且随着浓度不断增加，清除率也逐渐升高，表现出明显的剂量—效应关系。

在可溶性多糖浓度为32μg/mL的情况下，样1中富硒可溶性多糖对ABTS自由基的清除率最大，达到44.88％；样4最小为26.62％，说明在发酵过程中加入硒的时间与其对ABTS自由基的清除能力有关，随着加入时间的延迟，清除能力减弱。未富硒空白菌丝体中可溶性多糖的清除率为16.1％，与富硒组相比，清除能力较弱。

9、菌丝体中可溶性多糖还原力的研究

本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体，从菌丝体中提取可溶性多糖，利用不同浓度的可溶性多糖进行还原能力检测，如图7所示(图7中样1为第2d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样2为第3d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样3为第4d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样4为第5d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖)。

由图7可知，不同发酵时间加硒后，发酵得到的菌丝体中可溶性多糖有一定的还原力，且随着浓度不断增加，清除率也逐渐升高，表现出明显的剂量—效应关系。

在可溶性多糖浓度为32μg/mL的情况下，样1中富硒可溶性多糖还原力最大，在700nm的波长下吸光度值达到0.080，样2、样3、样4则分别为0065、0.047、0.038；说明在发酵过程中加入硒的时间与还原力大小有关，随着加入时间的延迟，清除能力减弱。未富硒空白菌丝体中可溶性多糖在700nm的波长下吸光度值为0.032，与富硒组相比，还原能力较弱。

通过对前期富硒荷叶离褶伞菌丝体中可溶性多糖与抗氧化能力线性关系的研究发现，其可溶性多糖含量越高，其抗氧化性越强，清除率比未富硒的要高。

以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例，显然本发明不仅仅限于以上实施例，还可以有其他变形。本领域的技术人员从本发明公开内容直接导出或间接引申的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。