一株具有抑菌作用的拜赖青霉mp6及其应用
技术领域
本发明属于微生物
技术领域
，具体涉及一株具有抑菌作用的拜赖青霉MP6及其应用。背景技术
目前，农业生产中由于连作普遍存在，使植物的根系代谢产物在土壤中逐渐积累，为土传真菌类病害提供了生长繁殖的环境，造成了农作物和蔬菜栽培中土传病害的日益加剧。作物被土传病原真菌侵染后，症状一般为疫病型和枯萎型，具体表现症状为植株枯萎，进而引起重大经济损失。其中，镰刀菌、疫霉菌和青枯菌是3种重要的土传病原真菌。
尖孢镰刀菌是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种镰刀菌枯萎病的发生。寄主被镰刀菌侵染后，症状表现多种多样，一般导致维管束褐变、植株萎蔫枯死、球茎和根腐烂、植株生长衰弱等。镰刀菌枯萎病是近年来对农业生产造成危害的一种重要的真菌性土传病害，在很多地区已有发生，尤其在作物重荏地发生程度更为严重，直接影响了农作物产量及其经济效益。
疫霉菌种类很多，其中烟草疫霉、辣椒疫霉和大豆疫霉是常见的疫霉菌。烟草疫霉引起的烟草黑胫病，主要侵染烟草的根和茎基部，在其上形成黑色凹陷的病斑。烟草黑胫病遍布全世界，特别是温带、亚热带和热带地区发生较严重。辣椒疫霉菌侵染引起辣椒疫病，是发生在辣椒上的常见病害。大豆疫霉侵染大豆引起大豆疫霉病，在大豆各生育期均可发病，其危害极其严重，具毁灭性，可引起大豆绝产。
茄科雷尔氏菌是引起青枯病的病原菌，该菌可侵染番茄、烟草等多种作物，侵入植物后，在维管束内繁殖，使维管束变褐腐烂，植物因缺乏水分而产生萎蔫，严重威胁作物生产安全。
目前防治植物病原菌引起的病害主要依靠化学农药，化学药剂的过度使用，不仅造成农产品农残超标，危害消费者的身体健康，还导致环境污染、破坏生态平衡，影响农业的可持续健康发展。生物防治是植物病害防治的重要措施之一，生防菌通过诱导寄主植物抗病性的产生或者通过对病原真菌的拮抗作用而到达防治或减轻病害的目的。生物菌剂或制剂可以减少或替代化学农药的使用，从而既能有效防治病害，又可避免化学农药的使用带来的负面效应。
发明内容
本发明的目的在于提供了一株对多种植物病原菌具有抑制作用的拜赖青霉MP6及其应用。所述拜赖青霉MP6具有显著抑制尖孢镰刀菌、大豆疫霉、烟草疫霉、辣椒疫霉、茄科雷尔氏菌生长的作用，其产生的发酵液可用于制备生防制剂，并具有良好的市场应用前景。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一株具有抑菌作用的拜赖青霉MP6，其分类命名为拜赖青霉Penicillium bilaiae，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021612。
进一步的，所述拜赖青霉MP6的ITS的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；其26S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
进一步的，所述拜赖青霉MP6的菌落菌丝发达且长度较短，呈毡状；分生孢子头呈扫帚状，分生孢子链状着生。
进一步的，所述拜赖青霉MP6能够有效抑制尖孢镰刀菌、烟草疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉和茄科雷尔氏菌的生长。
本发明还提供了所述的拜赖青霉MP6在用于制备防治枯萎病、疫霉病和/或青枯病的生防制剂中的应用。
进一步的，所述枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病；所述疫霉病是由烟草疫霉、辣椒疫霉和/或大豆疫霉引起的植物疫霉病；所述青枯病是由茄科雷尔氏菌引起的植物细菌性青枯病。
进一步的，所述拜赖青霉MP6能够显著抑制尖孢镰刀菌、烟草疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉和茄科雷尔氏菌的生长。
进一步的，所述拜赖青霉MP6能够抑制尖孢镰刀菌的菌丝生长、孢子萌发形成和芽管的伸长，并抑制烟草疫霉、辣椒疫霉的孢子萌发和芽管的伸长。
进一步的，所述生防制剂中含有拜赖青霉MP6发酵液。
进一步的，所述拜赖青霉MP6发酵液的制备方法为：将所述拜赖青霉MP6菌株接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，26℃震荡培养14天，12000 rpm条件下离心10 min后，上清液使用直径为0.22 μm的细菌过滤器过滤，得到不含有菌体的拜赖青霉MP6发酵液。
进一步的，所述赖青霉MP6发酵液在生防制剂中的体积比是1%-50%。
进一步的，所述生防制剂用于抑制尖孢镰刀菌的孢子萌发和芽管伸长时，所述赖青霉MP6发酵液在生防制剂中的体积比是15%-20%。
进一步的，所述生防制剂用于抑制尖孢镰刀菌的菌丝生长和孢子形成时，所述赖青霉MP6发酵液在生防制剂中的体积比是1%-10%。
进一步的，所述生防制剂用于抑制辣椒疫霉的孢子萌发和芽管伸长时，所述赖青霉MP6发酵液在生防制剂中的体积比是20%-50%。
进一步的，所述生防制剂用于抑制烟草疫霉的孢子萌发和芽管伸长时，所述赖青霉MP6发酵液在生防制剂中的体积比是30%-50%。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明从蔬菜地土壤中筛选到一株拜赖青霉MP6，该菌能够显著抑制尖孢镰刀菌、烟草疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉、茄科雷尔氏菌的生长，从而有效的抑制由尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病、疫霉菌引起的疫霉病、茄科雷尔氏菌引起的植物青枯病。所述拜赖青霉MP6的发酵产物对尖孢镰刀菌、烟草疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉、茄科雷尔氏菌的菌丝生长、孢子萌发形成、芽管伸长同样具有显著的抑制作用，因此该菌及其发酵液能够用来制备成生防制剂，进而增强植物对青枯病、疫霉病和枯萎病的抗性，且该生防制剂使用简单、效果好、安全可靠，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1是拜赖青霉MP6的菌落和分生孢子图；
图2是拜赖青霉MP6对烟草疫霉菌丝生长抑制结果；
图3是拜赖青霉MP6对辣椒疫霉菌丝生长抑制结果；
图4是拜赖青霉MP6对大豆疫霉菌丝生长抑制结果；
图5是拜赖青霉MP6对尖孢镰刀菌菌丝生长抑制结果；
图6是拜赖青霉MP6的发酵滤液对尖孢镰刀菌孢子萌发和芽管伸长的抑制结果；
图7是拜赖青霉MP6的发酵滤液对辣椒疫霉孢子萌发和芽管伸长的抑制结果；
图8是拜赖青霉MP6的发酵滤液对烟草疫霉孢子萌发和芽管伸长的抑制结果；
图9是拜赖青霉MP6的发酵滤液对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制结果；
图10是拜赖青霉MP6的发酵滤液对尖孢镰刀菌分生孢子形成的抑制结果；
图11是拜赖青霉MP6对茄科雷尔氏菌平板生长抑制结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：菌株的分离、筛选和鉴定
一、菌株的分离与筛选
2018年7月于青岛即墨采集蔬菜地土壤样品15份，将样品转入无菌水中，加入玻璃珠打散。随后用无菌水稀释至10-4~10-7倍，分别取200 μl涂PDA平板（取马铃薯200克洗净切块，加入适当水煮沸20~30分钟，纱布过滤取土豆汁，再加入葡萄糖20克，琼脂20克，定容至1000毫升，自然pH），26~28℃条件下培养。
挑取霉菌单菌落，利用平板对峙生长方法将单菌落和尖孢镰刀菌、烟草疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉分别接种于PDA平板，26~28℃条件下培养。通过计算测试霉菌对植物病原菌的菌丝生长抑制率，筛选出一株对尖孢镰刀菌、烟草疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉菌丝生长均具有很强抑制力的菌株，编号为MP6。
二、MP6菌株的分类鉴定
1、形态学鉴定：
参照青霉属的特征，测试了MP6菌株在PDA平板上的菌落形态和分生孢子形态。实验结果如图1显示，MP6菌株菌落的菌丝发达，但长度较短，呈毡状，分生孢子头呈扫帚状，分生孢子链状着生，这些特征符合青霉属的典型特征，因此确定MP6菌株为一株青霉。
2、分子鉴定：
利用通用引物ITS1/ ITS4和NL1/NL4进行PCR序列测定。其中，ITS序列引物：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG （SEQ ID No.1）；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC（SEQ ID No.2）。26SrDNA序列引物：NL1：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG（SEQ ID No.3）；NL4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG（SEQ ID No.4）。
PCR 反应体系如下：2×PCR Master Mix：12.5 μl；引物1：1 μl；引物2：1 μl；模板：1 μl；ddH2O：9.5 μl；
PCR反应程序如下：94℃ 预变性10 min；94℃ 变性30 s、52℃ 退火30 s、72℃ 延伸0.5 min，重复30个循环；72℃复性。
胶回收 PCR产物，进行 TA 克隆，挑取单菌落送测序公司测序。
经测序，所述MP6菌株的ITS片段序列如SEQ ID No.5所示；26S rDNA序列如SEQ IDNo.6所示。
经过NCBI 数据库比对，待检测菌株MP6与拜赖青霉（Penicillium bilaiae）MH1214菌株ITS（GenBank: LN901118.1）的序列匹配率为99.62%；与拜赖青霉（Penicillium bilaiae） NRRL 3391菌株28S rDNA（GenBank: AF033402.1）的序列匹配率为99.65%。通过综合分析，最终确定所筛选到的MP6菌株为拜赖青霉Penicillium bilaiae。
将本发明筛选到的拜赖青霉MP6菌株进行菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2021年5月26日，拜赖青霉Penicillium bilaiae MP6的保藏编号为CCTCC NO：M 2021612。
实施例2 拜赖青霉MP6的生防实验
1、MP6菌株对植物病原菌菌丝生长抑制作用
实验方法：将MP6菌株和4种病原菌（尖孢镰刀菌、烟草疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉）分别在PDA平板上，26~28℃活化培养3~5天备用；然后用打孔器在活化好的菌株菌丝边缘（生长状况尽量一致）打取圆形菌饼（直径0.60 cm），再用接种针分别将MP6菌株和测试疫霉的菌饼挑至新的平板两端，然后将培养皿倒置于培养箱（26~28℃）中培养。处理后及时观察测定菌丝的生长情况，抑菌效果如图2-5所示，结果显示MP6菌株对4种病原菌菌丝生长均具有较好的抑制效果。经计算可知，MP6菌株对烟草疫霉的菌丝生长抑制率为46.7%；MP6菌株对辣椒疫霉的菌丝生长抑制率为38.2%；MP6菌株对大豆疫霉的菌丝生长抑制率为52.1%；MP6菌株对尖孢镰刀菌的菌丝生长抑制率为53.3%，表明MP6菌株的抗菌具有广谱性。
2、MP6菌株的发酵滤液对孢子萌发和芽管伸长的抑制作用
实验方法：将挑取的MP6菌株接种到马铃薯葡萄糖液体培养基（不加琼脂的PDA培养基），26℃震荡培养14 d，然后12000 rpm条件下离心10 min，过滤，上清用直径为0.22 μm的细菌过滤器过滤，获得含有MP6菌株发酵物的发酵滤液（所述发酵滤液中不含有MP6菌，仅为MP6菌株的发酵产物）。
对所述发酵滤液进行不同浓度的稀释，采用凹玻片法检测（在灭菌的凹玻片中分别加入不同浓度的滤液50 μl，其中烟草疫霉孢子浓度为1.7×105 个/ml，辣椒疫霉孢子浓度为3.3×105 个/ml，尖孢镰刀菌孢子浓度为1.0×106 个/ml，26℃保湿培养，检测不同浓度的发酵滤液处理中孢子的萌发率并测量芽管的长度。
（1）MP6菌株的发酵滤液对尖孢镰刀菌孢子萌发和芽管伸长
培养12小时后，测定孢子的萌发率和芽管长度，结果如图6所示，随着发酵滤液含量的增加，对尖孢镰刀菌孢子萌发的抑制率明显提高。当含量超过20%时，对抑制尖孢镰刀菌孢子的萌发抑制率超过66%，表明MP6菌株的发酵产物对尖孢镰刀菌孢子萌发具有很强的抑制作用。经过测量芽管的长度，发现随着滤液浓度的提高，对芽管伸长的抑制率也越高，当含量15%时，对芽管的伸长抑制率为73.7%，说明尖孢镰刀菌孢子萌发的抑制率和芽管伸长的抑制率均呈剂量依赖性。
（2）MP6菌株的发酵滤液对辣椒疫霉孢子萌发和芽管伸长
培养2小时后，测定辣椒疫霉孢子的萌发率和芽管长度，结果如图7所示，随着发酵滤液含量的增加，对辣椒疫霉孢子萌发和芽管伸长也都受到显著抑制，当发酵滤液浓度为50%时，对孢子萌发的抑制率可达92.8%。辣椒疫霉孢子的萌发率和芽管伸长都随著MP6菌株发酵滤液的增加而提高，说明辣椒疫霉孢子萌发的抑制率和芽管伸长的抑制率也呈剂量依赖性。
（3）MP6菌株的发酵滤液对烟草疫霉孢子萌发和芽管伸长
培养1小时后，测定烟草疫霉孢子的萌发率和芽管长度，结果如图8所示，随着发酵滤液含量的增加，对烟草疫霉孢子萌发的抑制率和芽管伸长的抑制率也明显提高，当发酵滤液浓度为50%时，对孢子萌发的抑制率可达79.6%。烟草疫霉孢子的萌发率和芽管伸长都随著MP6菌株发酵滤液的增加而提高，说明烟草疫霉孢子萌发和芽管伸长的抑制率呈剂量依赖性。
3、MP6菌株的发酵滤液对尖孢镰刀菌菌丝生长和孢子形成的抑制作用
按照上述方法获得MP6菌株发酵滤液，在PDA培养基中添加不同发酵滤液含量（0.5%，1%，2%，4%，6%，8%，10%），将尖孢镰刀菌的菌饼接种到不同浓度的培养基上，培养6天后发现，随着发酵液的浓度的升高，菌丝生长受到的抑制也逐渐明显，使得菌落逐渐减小；0.5%的发酵液浓度的抑制效果与野生型相比几乎没有差别，但当发酵滤液浓度到达4%时，效果就十分明显。MP6菌株发酵滤液对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制效果如图9所示，随着发酵液浓度的增加，尖孢镰刀菌的菌落直径越来越小。将平板继续培养至12天，洗下各平板的孢子并计数，结果如图10，表明随着发酵液浓度的升高，尖孢镰刀菌的产孢数也随之下降，当浓度到达4%时，对尖孢镰刀菌孢子产生抑制率可达90.8%。表明MP6菌株的发酵滤液能够有效地抑制尖孢镰刀菌菌丝的生长以及孢子的产生，且抑制率呈剂量依赖性。
实施例3：拜赖青霉MP6对植物青枯病原菌茄科雷尔氏菌生长抑制作用
用无菌棉棒蘸取茄科雷尔氏菌菌液后，将其涂布在平板表面，然后接种拜赖青霉MP6菌株。将培养皿倒置于培养箱（26~28℃）中培养4~5天，测定MP6菌株对茄科雷尔氏菌的抑菌作用。测试结果如图11所示，发现MP6菌株的菌落周围出现明显的抑菌圈，表明拜赖青霉MP6对茄科雷尔氏菌的生长也有显著的抑制效果。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一株具有抑菌作用的拜赖青霉MP6及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 544
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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