一种促进丛枝菌根真菌非共生产孢的方法及其应用
技术领域
：本发明属于微生物培养
技术领域
，更具体的说，是涉及一种促进丛枝菌根真菌非共生产孢的方法。背景技术
：丛枝菌根真菌是一种活体营养型的、广泛存在于土壤中的共生真菌，属于球囊霉亚门，可以与80％陆地植物的根系建立共生关系。丛枝菌根真菌与植物建立共生关系后，可以极大地促进农作物的根系吸收矿质养分，如磷和氮，提高农作物对胁迫抗性，比如提高农作物对养分贫瘠、干旱、重金属毒害、酸碱度胁迫、病虫害等的耐受性，改善农作物的生长势，进而提高农作物的产量、改善农作物的品质。因此，丛枝菌根真菌在农业生产上具有很大的应用潜力。
现有的丛枝菌根真菌孢子的扩繁方法，需要与植物建立共生关系为前提。目前，丛枝菌根真菌孢子的扩繁主要有两种方式：一是使用高粱和三叶草组合(或者其他植物组合)作为宿主植物，在一定比例的土壤、河沙和硅藻土等基质中扩繁，这样获得的菌剂是以土壤为载体，该培养过程需要较大的植物培育空间；二是在培养皿等无菌条件下，建立丛枝菌根真菌和毛状根(如胡萝卜、番茄)的双重培养体系，在无菌条件下扩繁孢子等。由于毛状根双重培养体系获得的孢子是无菌的，在科研、生产等领域广泛应用。此外，该培养过程仅需在恒温培养箱中进行，不仅占地面积小、空间利用率高，而且不受外界环境(例如，光照和温度等)限制。
孢子是丛枝菌根真菌的重要繁殖体，孢子数量是量化菌剂质量的重要指标。因此，如何提高丛枝菌根真菌的孢子数量是其扩繁技术中的一个重要因素，也是有效提高菌剂质量的重要途径。
现有技术(申请号为201710058144.6)公开了一种丛枝菌根真菌的扩繁方法，使用玉米、万寿菊和三叶草作为宿主植物，在宿主植物生长过程中施加水和肥料进行丛枝菌根真菌的扩繁，并在扩繁后期采用不再施肥、减少浇水、植物轻微萎蔫或重度萎蔫再浇水使植物遭受干旱胁迫的措施，使得丛枝菌根真菌侵染率、孢子产量、扩繁效率均提高。但是，该方法是在非灭菌条件下进行的，获得的丛枝菌根真菌孢子携带杂菌，无法满足很多科学研究多科学研究对无菌孢子的要求。
现有技术(申请号为201911320670.0)公开了脱落酸在促进丛枝菌根真菌产孢中的应用，通过在丛枝菌根真菌的孢子中添加脱落酸，脱落酸能够直接作用于丛枝菌根真菌的孢子，显著提高丛枝菌根真菌孢子数量。技术(申请号为CN202010718350.7)赤霉素缺陷型突变体在促进丛枝菌根真菌产孢中的应用，通过使用番茄赤霉素缺陷突变体毛状根接种丛枝菌根真菌显著提高了丛枝菌根真菌的孢子产量，且赤霉素缺陷突变体毛状根显著提高了正常pH条件(pH 6.5)和酸性条件下(pH 4.5)丛枝菌根真菌的孢子数量。以上方法扩繁的孢子是无菌的，有利于在科研上对丛枝菌根真菌上深入研究。但是以上方法需要以根系作为宿主植物，丛枝菌根真菌与之建立共生关系之后才能产生孢子，步骤繁琐，且孢子生产的周期较长。
因此，研究一种非共生条件下扩操作简单、周期短，扩繁效率高、对外界环境依赖较小且能够显著增加产孢量的丛枝菌根真菌的扩繁方法具有重要意义，在实现丛枝菌根真菌纯培养方面又向前跨了一大步。
发明内容
：本发明要解决的技术问题是克服上述现有丛枝菌根真菌扩繁技术的缺陷和不足，提供一种促进丛枝菌根真菌非共生产孢的方法。
本发明的促进丛枝菌根真菌非共生产孢的方法，其是在丛枝菌根真菌的培养基中添加豆蔻酸钾、独脚金内酯、茉莉酸甲酯和蛋白胨。
本发明的第二个目的是提供一种促进丛枝菌根真菌非共生产孢的制剂，其是在丛枝菌根真菌的培养基中添加豆蔻酸钾、独脚金内酯、茉莉酸甲酯和蛋白胨。
优选，在所述的培养基中，豆蔻酸钾添加浓度为0.5mM，独脚金内酯添加浓度为100nM，茉莉酸甲酯添加浓度为1μM、蛋白胨添加浓度为1mg/L。
优选，所述的培养基为：每升含有：MgSO4·7H2O：739mg；KNO3：76mg；KCl：65mg；Ca(NO3)2·4H2O：359mg；KH2PO4：4.1mg；MnSO4·4H2O：2.45mg；ZnSO4·7H2O：0.28mg；H3BO3：1.85mg；CuSO4·5H2O：0.22mg；(NH4)6Mo7O24·4H2O：0.034mg；NaMoO4·2H2O：0.0024mg；盐酸硫胺素(VB1)：1mg；盐酸吡哆醇(VB6)：0.9mg；烟酸：1mg；泛酸钙：0.9mg；维生素B12：0.4mg；生物素：0.0009mg；NaFeEDTA：8mg；蔗糖：1g；植物凝胶：2.5g；葡萄糖：1g；蛋白胨：1mg；豆蔻酸钾：0.5mmol；独脚金内酯：100nmol；茉莉酸甲酯：1μmol，溶剂为水。
优选，所述的丛枝菌根真菌是异形根孢囊霉DAOM197198。
本发明的第三个目的是提供上述豆蔻酸钾、独脚金内酯、茉莉酸甲酯和蛋白胨在促进丛枝菌根真菌非共生产孢中的应用。
优选是在丛枝菌根真菌的培养基中添加豆蔻酸钾、独脚金内酯、茉莉酸甲酯和蛋白胨。
本发明具有以下有益效果：
本发明经过创造性的探索实验，通过在丛枝菌根真菌的孢子中添加豆蔻酸钾、独脚金内酯、茉莉酸甲酯和蛋白胨，显著提高丛枝菌根真菌孢子生产量，添加处理中丛枝菌根真菌单个母孢子产生的孢子量是不添加处理的9倍。添加豆蔻酸钾、独脚金内酯、茉莉酸甲酯和蛋白胨能够显著提高非共生条件下的丛枝菌根真菌孢子生产量。
基于此，本发明提供了促进丛枝菌根真菌非共生产孢的制剂和方法，该方法能够在非共生体系中扩繁丛枝菌根真菌，扩繁效率高且能够显著增加丛枝菌根真菌的产孢量，还具有操作简便、成本低、周期短等优点；因此，在促进丛枝菌根真菌产孢或制备促进丛枝菌根真菌产孢的制剂中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是实施例1中异形根孢囊霉DAOM197198在非共生培养体系中的产孢情况；其中，A是在改良的MSR培养基上的产孢情况；B是在基础MSR培养基上的产孢情况。白色箭头处是母孢子，黑色(A)或灰色(B)箭头处是由母孢子产生的子孢子。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1不同培养基对非共生条件下丛枝菌根真菌的产孢量的影响
1、实验方法
本实施例选用丛枝菌根真菌的模式菌种(异形根孢囊霉DAOM197198)来研究改良MSR培养基对非共生条件下丛枝菌根真菌的孢子生产量的影响，具体的实验方法和实验结果分别如下：
(1)称取0.3mg的独脚金内酯，用1mL的丙酮溶解，配置成1mM的独脚金内酯溶液。
(2)称取11.4mg茉莉酸甲酯，用5ml的无水乙醇溶解，配置成10mM的茉莉酸甲酯溶液。
(3)称取1.33g豆蔻酸钾，用10ml双蒸水溶解，配置成0.5M的豆蔻酸钾溶液。
(4)用0.22μm有机相的有机尼龙(nylon)66对独脚金内酯溶液和茉莉酸甲酯溶液过滤除菌。用0.22μm无机相的聚醚砜(PES)滤膜对豆蔻酸钾溶液进行过滤除菌。
(5)MSR基础培养基的配方为(1L水中的添加量)：MgSO4·7H2O：739mg；KNO3：76mg；KCl：65mg；Ca(NO3)2·4H2O：359mg；KH2PO4：4.1mg；MnSO4·4H2O：2.45mg；ZnSO4·7H2O：0.28mg；H3BO3：1.85mg；CuSO4·5H2O：0.22mg；(NH4)6Mo7O24·4H2O：0.034mg；NaMoO4·2H2O：0.0024mg；盐酸硫胺素(VB1)：1mg；盐酸吡哆醇(VB6)：0.9mg；烟酸：1mg；泛酸钙：0.9mg；维生素B12：0.4mg；生物素：0.0009mg；NaFeEDTA：8mg；蔗糖：10g；植物凝胶：2.5g。按成分及含量，将各成分混合均匀，调pH：5.5，封好口后121℃高温高压灭菌15min。由此得到MSR培养基。
(6)改良的MSR培养基的配置：在1L MSR培养基中，将其中的蔗糖添加量改为1g，并再添加葡萄糖1g，蛋白胨1mg，其它成分与基础MSR培养基的一致，调节pH为5.5，封好口后121℃高温高压灭菌15min。然后于超净工作台上向高温高压灭菌后的培养基中加入过滤除菌后的1mM的独脚金内酯溶液100μL、10mM的茉莉酸甲酯溶液100μL、0.5M的豆蔻酸钾溶液1mL，使豆蔻酸钾、独脚金内酯和茉莉酸甲酯最终使用浓度分别为0.5mM、100nM和1μM，混合均匀后倒入培养皿中备用。
(7)于超净工作台上向高温高压灭菌后的MSR培养基中加入与改良的MSR培养基等量的溶剂(丙酮、无水乙醇和双蒸水)，混合均匀后倒入培养皿中备用。
(8)将在毛状根-丛枝菌根真菌双重培养体系中扩繁的异形根孢囊霉DAOM197198的孢子培养基上的一半培养物全部转移至50mL离心管中，加入3倍体积10mM pH6.0的柠檬酸钠溶液，在摇床上震荡(震荡转速为120rpm，温度为25℃)1h后，用25μm的尼龙膜将所述溶液过滤，获得备用的孢子。
(9)在体视显微镜下用解剖针将孢子分散开，接种到培养基中，每个培养皿中接种50个左右的孢子，每个处理5个重复，用封口膜封口，置于恒温培养箱中暗培养(培养温度为25℃)。
(10)在25℃恒温培养箱中暗培养培养6周后，将培养皿拿出，倒置放在体视显微镜下观察并统计每个培养皿中新形成孢子的数量。
2、实验结果
本实施例1中番茄毛状根-异形根孢囊霉DAOM197198非公生培养体系的产孢情况如图1所示，可以看出，在添加了豆蔻酸钾、独脚金内酯、茉莉酸甲酯、蛋白胨的改良MSR培养基的非共生培养体系中，异形根孢囊霉DAOM197198产生了大量的新孢子。
改良MSR培养基对非共生条件下的丛枝菌根真菌孢子生产量的影响结果如表1所示，可以看出，与基础MSR培养基相比，添加了豆蔻酸钾、独脚金内酯、茉莉酸甲酯、蛋白胨的改良MSR培养基处理的非生条件下的丛枝菌根真菌单个母孢子产生的子孢子数量是基础MSR培养基处理的9倍，表明改良的MSR培养基显著提高了非生条件下的丛枝菌根真菌的孢子生产量。
表1非共生条件下的不同处理对丛枝菌根真菌孢子生产量的影响
处理组
单个母孢子产生的子孢子数量
基础MSR培养基
0.65±0.08
改良MSR培养基
5.47±0.62***
注：“***”表示独立样本T检验在P≤0.001水平时有显著差异。
对照例1豆蔻酸钾对非共生条件下丛枝菌根真菌产孢量的影响
1、实验方法
本实施例选用丛枝菌根真菌的模式菌种(异形根孢囊霉DAOM197198)来研究改良豆蔻酸钾对非共生条件下丛枝菌根真菌的孢子生产量的影响，具体的实验方法和实验结果分别如下：
(1)称取1.33g豆蔻酸钾，用10ml双蒸水溶解，配置成0.5M的豆蔻酸钾溶液，用0.22μm无机相的聚醚砜(PES)滤膜对豆蔻酸钾溶液进行过滤除菌。
(2)MSR基础培养基的配方为(1L中的添加量)：MgSO4·7H2O：739mg；KNO3：76mg；KCl：65mg；Ca(NO3)2·4H2O：359mg；KH2PO4：4.1mg；MnSO4·4H2O：2.45mg；ZnSO4·7H2O：0.28mg；H3BO3：1.85mg；CuSO4·5H2O：0.22mg；(NH4)6Mo7O24·4H2O：0.034mg；NaMoO4·2H2O：0.0024mg；盐酸硫胺素(VB1)：1mg；盐酸吡哆醇(VB6)：0.9mg；烟酸：1mg；泛酸钙：0.9mg；维生素B12：0.4mg；生物素：0.0009mg；NaFeEDTA：8mg；蔗糖：10g，植物凝胶2.5g，溶剂为水。按成分及含量，将各成分混合均匀，调pH至5.5后。封好口后121℃高温高压灭菌15min。
(3)取MSR培养基在超净工作台上倒入培养皿冷却凝固后备用，作为对照。
(4)MSR培养基待冷却至40℃左右时，添加过滤灭菌的0.5M的豆蔻酸钾(myr)溶液，使豆蔻酸钾最终使用浓度分别为0.5mM，混匀后倒入培养皿中备用。
(5)将在毛状根-丛枝菌根真菌双重培养体系中扩繁的异形根孢囊霉DAOM197198的孢子培养基上的一半培养物全部转移至50mL离心管中，加入3倍体积10mM pH6.0的柠檬酸钠溶液，在摇床上震荡(震荡转速为120rpm，温度为25℃)1h后，用25μm的尼龙膜将所述溶液过滤，获得备用的孢子。
(6)在体视显微镜下用解剖针将孢子分散开，接种到MSR培养基中，每个培养皿中接种50个左右的孢子，每个处理5个重复，用封口膜封口，置于恒温培养箱中暗培养(培养温度为25℃)。
(7)在25℃恒温培养箱中暗培养培养6周后，将培养皿拿出，倒置放在体视显微镜下观察并统计每个培养皿中新形成孢子的数量。
2、实验结果
从表2可以看出在MSR培养基添加豆蔻酸钾显著促进了非共生孢子的形成，每个母孢子能产生1.6个子孢子，而在不添加豆蔻酸钾的MSR培养基上每个母孢子仅能产生0.7个子孢子，添加豆蔻酸钾处理(myr)后每个母孢子的产孢量是不添加处理(MSR)的2.4倍。但是不如实施例1的改良MSR培养基，其是基础MSR培养基处理的9倍。
表2豆蔻酸钾对非共生条件下丛枝菌根真菌孢子生产量的影响
处理组
单个母孢子产生的子孢子数量
MSR
0.67±0.14
添加myr的MSR
1.58±0.32*
注：“*”表示独立样本T检验在P≤0.05水平时有显著差异。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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