本发明涉及高速逆流色谱分离纯化何首乌叶中黄酮类化合物的方法,包括以下步骤:(1)何首乌叶乙酸乙酯相的制备(2)采用体积比为1:1:1:0.5~2:2:5:1的水-甲醇-乙酸乙酯-正己烷溶液为溶剂体系,将固定相、流动相泵入高速逆流色谱仪;待两相溶剂体系在高速逆流柱中达到平衡时,将所述何首乌叶乙酸乙酯相溶于所述两相溶剂体系,进行高速逆流色谱分离;在所述高速逆流色谱分离时,紫外检测器检测波峰,从出峰开始进行收集直至峰消失为止停止收集,分别收集不同馏分进行减压浓缩冷冻干燥,得到杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷。本发明分离纯化黄酮类化合物单体纯度高、损失小、操作简单、制备量大、经济环保。