高速逆流色谱分离纯化何首乌叶乙酸乙酯相中黄酮类化合物的方法
技术领域
本发明涉及天然产物化学领域，尤其涉及高速逆流色谱分离纯化何首乌叶乙酸乙酯相中黄酮类化合物的方法。
背景技术
何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)，又名夜交藤，首乌藤，为蓼科(Polygonaceae)何首乌属(Fallopia Adans.)多年生草本植物何首乌的干燥块茎。在《本草纲目》、《中国药典》上均有收录记载，《本草纲目》曰“性甘、平；归心、肝经。具有养血安神、祛风通络的功效。用于失眠多梦、血虚身痛、风湿痹痛、皮肤瘙痒等症。”研究表明：何首乌中含有多种生物活性类物质，其中最主要的包括黄酮类化合物、二苯乙烯苷类化合物、蒽醌类化合物、多酚类化合物和磷脂类及脂肪酸类等活性成分。现代药理研究表明，何首乌具有镇静安神、抗慢性炎症及抗菌等作用，其中的黄酮类化合物也有着抗氧化、抗衰老、抗癌和降三高的作用。
国内外学者对何首乌化学成分的研究多集中在其块根和藤茎上，并得出何首乌块根和藤茎中含有大量的黄酮类化合物、二苯乙烯苷类化合物、多酚类化合物、蒽醌类化合物和磷脂类及脂肪酸类等化学活性成分[何首乌化学成分与药理作用研究进展，中国实验方剂学杂志，2019年第13期]，但在何首乌除去块根藤茎之后，对其剩余部分的研究较少(仅有饶高雄等[首乌叶化学成分研究，中药材，2009年第6期]对何首乌叶进行化学成分研究，并分离得到黄酮类和甾体及其苷类等化合物。现有的分离技术中一般采用传统柱层析分离，重结晶等方法从何首乌样品中提取分离单体化合物，这些方法需反复经过柱层析分离，操作复杂，耗时长，不仅溶剂消耗量大，而且样品损失也大，分离效果差。高速逆流色谱是近年来新兴的一种快速分离色谱分离技术，无需固定相为载体是其最大优势，同时具有溶剂用量少、分离速度快、进样量大、样品回收率高等独特优点，现已广泛应用于植物化学、中药化学以及天然产物化学物质的制备分离和纯化。
发明内容
本发明的目的是提供一种高速逆流色谱分离纯化何首乌叶乙酸乙酯相中黄酮类化合物的方法，可以从何首乌叶乙酸乙酯相中分离纯化多个黄酮类化合物单体。
为了解决上述技术问题，本发明是这样实现的：
高速逆流色谱分离纯化何首乌叶乙酸乙酯相中黄酮类化合物的方法，包括以下步骤：
(1)何首乌叶乙酸乙酯相的制备
将何首乌叶干燥后，以乙醇为溶剂进行超声提取1～3次，提取时间为1～4h，超声提取的固液比为1：10～1：20，之后抽滤并合并滤液，进行真空减压浓缩除去溶剂，得到何首乌叶乙醇提取物，之后加入乙酸乙酯和水进行多次萃取，将萃取完全后的乙酸乙酯相进行真空减压浓缩去溶剂，得到何首乌叶乙酸乙酯相；
(2)高速逆流色谱分离纯化
采用体积比为1:1:1:0.5～2:2:5:1的水-甲醇-乙酸乙酯-正己烷溶液为溶剂体系，将固定相以20～30mL/min流速泵入高速逆流色谱仪，待所述固定相充满整个柱子后，3～5mL/min的流速泵入流动相，同时调节高速逆流色谱仪转速至800～900rpm；待两相溶剂体系在高速逆流柱中达到平衡时，将所述何首乌叶乙酸乙酯相溶于所述两相溶剂体系，进样浓度为5mg/mL～20mg/mL，进样体积为10～30mL，进行高速逆流色谱分离；在所述高速逆流色谱分离时，用波长200～300nm的紫外检测器检测，以单个波峰为单位，从出峰开始进行收集直至峰消失为止停止收集，分别收集不同馏分进行减压浓缩冷冻干燥，得到杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷。
特别地，所述的水-甲醇-乙酸乙酯-正己烷的体积比为2:1～3:2～5:0.5。
特别地，所述步骤(2)中，所述的水-甲醇-乙酸乙酯-正己烷的体积比为2:1:3:0.5。
特别地，所述步骤(2)中，所述进行高速逆流色谱分离时，分离柱转速为850rpm，流动相流速为5mL/min，紫外检测器波长为254nm，进样浓度为11mg/mL，进样体积为10mL。
特别地，所述步骤(1)中，所述超声提取的乙醇溶液浓度为80％。
特别地，所述步骤(1)中，超声提取的固液比为1：10～1：20。
特别地，所述步骤(1)中，所述超声提取的固液比为1：15，提取次数为2次。
本发明能够分离纯化杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷三种黄酮类单体，相对于现有技术，本发明可以一次性从何首乌叶乙酸乙酯相中分离纯化三种黄酮类化合物单体，分离纯化黄酮类化合物单体效率高、操作简单、综合成本低、分离量大、产品纯度高、样品损失小；本发明分离纯化得到黄酮类单体经高效液相色谱法(HPLC，High PerformanceLiquid Chromatography)纯度达到90％以上，各馏分经制备液相色谱提纯可得到95％以上的纯品杨梅苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-鼠李糖苷。
附图说明
图1是采用体积比2:1:3:0.5的水-甲醇-乙酸乙酯-正己烷为溶剂体系的高速逆流色谱分离纯化何首乌叶乙酸乙酯相的色谱图；
图2是分离纯化得到的杨梅苷的高效液相色谱图；
图3是分离纯化得到的槲皮苷的高效液相色谱图；
图4是分离纯化得到的山柰酚-3-O-鼠李糖苷的高效液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如下详细介绍本发明提供的分离纯化何首乌叶乙酸乙酯相中黄酮类化合物的方法：
步骤一：何首乌叶乙酸乙酯相的制备
将干燥后的何首乌叶1.0kg，以90％浓度的乙醇为溶剂进行超声提取，提取时间为2h，超声提取的固液比为1：15，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并进行真空减压浓缩至无乙醇味，得到何首乌叶乙醇提取物，之后加入乙酸乙酯和水进行多次萃取。将萃取完全后的乙酸乙酯相进行真空减压浓缩去溶剂，得到何首乌叶乙酸乙酯相。
步骤二：黄酮类单体分离
采用体积比1:1:1:0.5～2:2:5:1的水-甲醇-乙酸乙酯-正己烷为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以20～30mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以3～5mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节逆流色谱仪转速至700～900rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将何首乌叶乙酸乙酯相溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为5mg/mL～20mg/mL，进样体积为10mL～30mL，对何首乌叶乙酸乙酯相进行高速逆流色谱(High-Speed Counter-CurrentChromatography，HSCCC)分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为200～300nm，根据色谱峰分别收集相应的峰组分，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物；
步骤三：黄酮类单体纯度测定及结构测定
收集到的各馏分别经1H-NMR(核磁共振，Nuclear Magnetic Resonance)和13C-NMR鉴定。
实施例1
步骤一：何首乌叶乙酸乙酯相的制备
将干燥后的何首乌叶1.0kg，以90％浓度的乙醇为溶剂进行超声提取，提取时间为2h，超声提取的固液比为1：15，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并进行真空减压浓缩至无乙醇味，得到何首乌叶乙醇提取物，之后加入乙酸乙酯和水进行多次萃取。将萃取完全后的乙酸乙酯相进行真空减压浓缩去溶剂，得到何首乌叶乙酸乙酯相。
步骤二：黄酮类单体分离
采用体积比2:1:3:0.5的水-甲醇-乙酸乙酯-正己烷为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以20mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以5mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节逆流色谱仪转速至850rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将何首乌叶乙酸乙酯相溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为11mg/mL，进样体积为10mL，对何首乌叶乙酸乙酯相进行高速逆流色谱(High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC)分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为254nm，根据色谱峰分别收集相应的峰组分，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物，如图1所示。
杨梅苷(Ⅰ)、槲皮苷(Ⅱ)和山柰酚-3-O-鼠李糖苷(Ⅲ)。
步骤三：黄酮类单体纯度测定及结构测定
收集到的各馏分别经1H-NMR(核磁共振，Nuclear Magnetic Resonance)和13C-NMR鉴定，所得单体化合物分别为杨梅苷30.93mg、槲皮苷23.2mg和山柰酚-3-O-鼠李糖苷13.38mg；收集到各分馏物分别经HPLC检测，以色谱峰面积归一化法计算，测量各杂质峰的面积和总色谱峰面积，计算各杂质峰面积及其之和占总峰面积的百分率，样品纯度即为去掉杂质峰之和所占的百分率。如图2所示，色谱峰面积归一化法计算可知杂质峰的峰面积为5.1％，总色谱峰面积为1，计算可得杨梅苷纯度为94.9％，同理可知槲皮苷纯度为97.0％，山柰酚-3-O-鼠李糖苷纯度为95.7％；杨梅苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-鼠李糖苷的高效液相色谱图分别如图2～图4所示。
实施例2
步骤一：何首乌叶乙酸乙酯相的制备
将干燥后的何首乌叶1.0kg，以85％浓度的乙醇为溶剂进行超声提取，提取时间为1h，超声提取的固液比为1：20，过滤，滤渣重复处理1次；合并滤液并进行真空减压浓缩至无乙醇味，得到何首乌叶乙醇提取物，之后加入乙酸乙酯和水进行多次萃取。将萃取完全后的乙酸乙酯相进行真空减压浓缩去溶剂，得到何首乌叶乙酸乙酯相。
步骤二：黄酮类单体分离
采用体积比2:2:4:0.5的水-甲醇-乙酸乙酯-正己烷为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以25mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以4mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节逆流色谱仪转速至800rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将何首乌叶乙酸乙酯相溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为15mg/mL，进样体积为20mL，对何首乌叶乙酸乙酯相进行HSCCC分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为270nm，根据色谱峰分别收集相应的峰组分，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。
步骤三：黄酮类单体纯度测定及结构测定
应用高效液相色谱检测单体化合物的纯度同实施1中步骤三。
实施例3
步骤一：何首乌叶乙酸乙酯相的制备
将干燥后的何首乌叶1.0kg，以95％浓度的乙醇为溶剂进行超声提取，提取时间为3h，超声提取的固液比为1：10，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并进行真空减压浓缩至无乙醇味，得到何首乌叶乙醇提取物，之后加入乙酸乙酯和水进行多次萃取。将萃取完全后的乙酸乙酯相进行真空减压浓缩去溶剂，得到何首乌叶乙酸乙酯相。
步骤二：黄酮类单体分离
采用体积比2:1:4:1的水-甲醇-乙酸乙酯-正己烷为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以20mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以3mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节逆流色谱仪转速至900rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将何首乌叶乙酸乙酯相溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为20mg/mL，进样体积为20mL，对何首乌叶乙酸乙酯相进行HSCCC分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为230nm，根据色谱峰分别收集相应的峰组分，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。
步骤三：黄酮类单体纯度测定及结构测定
应用高效液相色谱检测单体化合物的纯度同实施1中步骤三。
实施例4
步骤一：何首乌叶乙酸乙酯相的制备
将干燥后的何首乌叶1.0kg，以80％浓度的乙醇为溶剂进行超声提取，提取时间为3h，超声提取的固液比为1：20，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并进行真空减压浓缩至无乙醇味，得到何首乌叶乙醇提取物，之后加入乙酸乙酯和水进行多次萃取。将萃取完全后的乙酸乙酯相进行真空减压浓缩去溶剂，得到何首乌叶乙酸乙酯相。
步骤二：黄酮类单体分离
采用体积比2:1:5:0.5的水-甲醇-乙酸乙酯-正己烷为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以15mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以3mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节逆流色谱仪转速至800rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将何首乌叶乙酸乙酯相溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为20mg/mL，进样体积为10mL，对何首乌叶乙酸乙酯相进行HSCCC分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为300nm，根据色谱峰分别收集相应的峰组分，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。
步骤三：黄酮类单体纯度测定及结构测定
应用高效液相色谱检测单体化合物的纯度同实施1中步骤三。
实施例5
步骤一：何首乌叶乙酸乙酯相的制备
将干燥后的何首乌叶1.0kg，以75％浓度的乙醇为溶剂进行超声提取，提取时间为2.5h，超声提取的固液比为1：10，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并进行真空减压浓缩至无乙醇味，得到何首乌叶乙醇提取物，之后加入乙酸乙酯和水进行多次萃取。将萃取完全后的乙酸乙酯相进行真空减压浓缩去溶剂，得到何首乌叶乙酸乙酯相。
步骤二：黄酮类单体分离
采用体积比2:1:2:0.5的水-甲醇-乙酸乙酯-正己烷为溶剂体系，充分摇匀后静置，按上下相分开，上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，将固定相以30mL/min流速注入高速逆流色谱仪，待固定相充满整个柱子后，以4mL/min的流速注入流动相，形成两相溶剂体系，调节逆流色谱仪转速至820rpm；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡时，将何首乌叶乙酸乙酯相溶于两相溶剂体系，制成分离样品，进入高速逆流色谱仪进行分离的样品浓度为进样浓度，进样浓度为15mg/mL，进样体积为25mL，对何首乌叶乙酸乙酯相进行HSCCC分离；在高速逆流色谱分离时，紫外检测器在线监测，检测波长为200nm，根据色谱峰分别收集相应的峰组分，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。
步骤三：黄酮类单体纯度测定及结构测定
应用高效液相色谱检测单体化合物的纯度同实施1中步骤三。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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