具体实施方式

本发明所提供的实施例均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如表1。

表1 MMDaV侵染性克隆载体构建引物

实施例1桑花叶型矮缩相关病毒侵染性克隆pBin-MMDaV 2A的构建

(1)植物总DNA的提取：采用CTAB方法从采集的感染MMDaV的桑树中提取植物基因组总DNA。

具体操作方法为：取0.1g植物叶片于2mL离心管中，加入5mm的钢珠，放入液氮中速冻后置于研磨仪中40HZ研磨60s研磨成粉末。向研磨好的粉末中加入500μL 65℃预热的CTAB抽提液(使用时加入2％的β-巯基乙醇)，混匀后置于65℃金属浴中加热1h，期间颠倒混匀3-4次。加入与抽提液体积相同的24:1的氯仿：异戊醇(现用现配)，上下摇动以混合均匀，4℃，10000rpm离心5min。用移液枪吸取上清液于1.5mL的离心管中，加入1/10体积的3M的醋酸钠溶液(pH5.2)和等体积﹣20℃预冷的无水乙醇，混匀后在﹣20℃放置1h。4℃，12000rpm离心5min，弃上清，用500mL 70％的乙醇清洗沉淀三次，每次4℃，10000rpm离心3min。弃上清，室温干燥10min左右，加入30μL 65℃预热的的去离子水，用移液枪吸打混匀。提取的总DNA样品置于-20℃保存。

(2)MMDaV全长序列的克隆和测序：利用PCR扩增体系，以含有MMDaV病毒的桑树DNA为模板，以MMDaV FL/SalI-F和MMDaV FL/KpnI-R(插入SalI和KpnI位点)为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：15μL ddH2O、5μL 5×TransStart FastPfu buffer、0.5μL 5’端引物(10μmol/L)、2μL 2.5mM dNTPs、0.5μL 3’端引物(10μmol/L)、1μL TransStart FastPfuDNAPolymerase、1μL模板，最终总体积为25μL。反应参数为：95℃预变性2min后进行循环反应：95℃变性20s、50℃退火20s、72℃延伸2kb/min，循环35次后，72℃延伸10min。扩增后的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳并纯化后插入到pEasy-T1载体上，筛选得到pEasy T1-MMDaV-PL(含有SalI和KpnI特异性酶切位点)，测序并拼接后获得1个拷贝的MMDaV的全长序列。以MMDaV FL/KpnI-F和MMDaV FL/KpnI-R(插入KpnI位点)为引物扩增MMDaV全长序列(2952nt)，同样将PCR产物插入到pEasy-T1载体上，筛选得到pEasy T1-MMDaV-FL(含有KpnI特异性酶切位点)，测序并拼接后获得另1个拷贝的MMDaV的全长序列。所述的引物MMDaVFL/SalI-F、MMDaV FL/KpnI-F和MMDaV FL/KpnI-R的基因序列分别为SEQ ID NO:1，SEQ IDNO:2，SEQ ID NO:3；MMDaV的全序列如SEQ ID NO：6所示。

(3)pBinPLUS-MMDaV-PL的克隆：通过酶切回收方法将测序正确的pEasy T1-MMDaV-PL质粒用SalI和KpnI限制性酶进行酶切，回收目的片段(3000bp左右)。酶切体系为：25μL质粒、8μL ddH₂O、1μL SalI、1μL KpnI、5μL 10×buffer，最终总体积为40μL，经混匀短暂离心后，37℃反应30-40min。同时再将植物双元表达载体pBinPLUS用SalI和KpnI限制性酶进行酶切并且纯化后，利用T4 DNA连接酶，将SalI和KpnI限制性酶酶切后的MMDaV片段与pBinPLUS连接得到pBinPLUS-MMDaV-PL。连接体系为：250ng的MMDaV片段、1μL 10×T4ligation buffer、1μL T4 ligase、100ng酶切后的pBinPLUS载体、补充ddH₂O至总体积为10μL，样品混匀后短暂离心，22℃反应30min。

(4)pBin-MMDaV 2A的克隆：将测序正确的pEasy T1-MMDaV-FL质粒用KpnI限制性酶酶切，回收约3000bp的目的片段。同时用KpnI限制性酶酶切pBinPLUS-MMDaV-PL质粒，琼脂糖凝胶回收纯化后，利用T4 DNA连接酶将同样用KpnI限制性酶酶切回收的MMDaV片段与pBinPLUS-MMDaV-PL片段连接，具体操作体系参考(3)；筛选含有2个串联重复的克隆，提取包含2个串联重复的质粒，将该方法构建的MMDaV的侵染性克隆命名为pBin-MMDaV 2A(如图1所示)。

实施例2 pBin-MMDaV 2A侵染性克隆接种

通过电击转化方法将pBinPLUS-MMDaV 2A质粒转入到农杆菌菌株EHA105中，获得含有MMDaV侵染性克隆的农杆菌。将含有桑花叶型矮缩相关病毒重组植物表达载体的农杆菌接种于含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(50mg/L)抗性的LB培养基中，28℃220rpm摇菌培养至OD600为0.8-1.2；经10000rpm离心5分钟，弃上清，用含10mM MgCl₂、10mM MES、100mM乙酰丁香酮的浸润缓冲液重新悬浮菌体，调整OD600至1.2，室温静置3小时后浸润植物。选取4～6片真叶的本氏烟，在叶片背面先用针头轻轻扎几个小孔，利用不带针头的1mL注射器缓慢将菌液渗透注射到组织间隙中，接种植物置于25℃隔离温室培养。

实施例3 pBin-MMDaV 2A侵染性克隆的侵染性测定

定期对接种植株进行症状观察，监测MMDaV侵染性克隆在植物上引起的变化。在白光和紫外灯下对接种的本氏烟进行观察，发现pBin-MMDaV 2A农杆菌浸润本氏烟3天后，接种叶表现明显的坏死表型(图2A和2B)。利用DAB对接种叶进行染色，发现接种MMDaV侵染性克隆的叶片出现了明显的褐色。

具体操作如下：将接种叶片剪下，放入50mL离心管中，注意轻拿轻放。向其中加入配置好的DAB-HCl溶液(1mg/mL，pH＝3.8)，没过叶片即可。光下常温放置8h，期间不时晃动。倒去DAB-HCl溶液，加入96％的酒精，沸水煮5-10min直至绿色褪去，则产生H₂O₂的位置将变为褐色。自然冷却后加入70％的酒精保存，拍照记录(图2C)。

对接种植株进行PCR检测以鉴定其侵染性：可用引物V4 GW-F和C1C2 GW-F进行PCR检测，扩增大小约为1500bp；所述的引物V4 GW-F和C1C2 GW-F基因序列分别为SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，结果如图3显示，接种MMDaV侵染性克隆的植物叶片可检测到特异性目的条带。

以上结果证明：构建的MMDaV侵染性克隆具有生物学活性，侵染本氏烟后能够迅速激活植物的防卫反应，引起叶片坏死。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 桑花叶型矮缩相关病毒MMDaV侵染性克隆载体及其构建方法和应用

<130> DS211-018

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> MMDaV FL/SalI-F(Artificial Sequence)

<400> 1

gggtcgacat ttgacccatt ttgaccatgg 30

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> MMDaV FL/KpnI-F(Artificial Sequence)

<400> 2

ggggtaccat ttgacccatt ttgacc 26

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> MMDaV FL/KpnI-R(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggtaccca ttaccaccag tatg 24

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> V4 GW-F(Artificial Sequence)

<400> 4

caccatgttt tcaaggagaa aaaaag 26

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> C1C2 GW-F(Artificial Sequence)

<400> 5

caccatggct tcaagttcta acttcag 27

<210> 6

<211> 2952

<212> DNA

<213> 桑花叶型矮缩相关病毒(Artificial Sequence)

<400> 6

acagccccct cgcttggtgg cgccacgtgg cgcccgtgga ttggccccga aggggcccac 60

cattaattgc gccgaaggcg caatgtgaac ccgacaaaag gaggcggccg acaaaagaaa 120

aagaaaaaga aaagtaaaaa gaaaaaggga aaagttaaag cagattcgcc gacagttttt 180

aaaagtgggt cccatgaata attattaaag aggttgcttg cgcagcaagg aaccgatgag 240

ctataaatac ccccctgccc caaatatttt taaaatgtct gagtattgcg aacttgccga 300

agacagtaag tactgtacaa cgattttaat tgttcaattt attgttattg ccctagccat 360

tctcagttat gtctttgtgg agtaccaaat taggagagtt gcctcagagc ttgcaaggct 420

gcgtaattat gctagcctgc aagcaattaa tggcaatgga agaccagatt ctggcccaga 480

aaatagacat gagaaccgag accgggttcg agacttcagt ggaccacttg gtccacctta 540

ctcagtgccg tagactgttg agactgataa gacgtttttc tagggtaaag gatcgtgctg 600

cagtaaatgg tgattaccag gagctctgct ctgagatcaa ggcggggatg gaatccagga 660

accattccac ggaggcccag gactgttcga gtcacgcggg ttgcaagtgc catgcgaacc 720

ccgtggagaa gaagaggccc aaggtcgagt ttggcaagaa ggaagagacg gcccataaat 780

gcgttgggcc cagtgaaacg tggcacattt ggaattaaat tagccagtat aaatcatact 840

ggtggtaatg ggtaccattt gacccatttt gaccatgggg atgacacaaa ccaaagaacc 900

ggaagaaaaa taaaaattaa tggaataaac attaggggaa aactgtacct aaataatcct 960

aggactaatt cttatcacat tgtcaggctg tggataatca gggataccag accggggtcg 1020

gaaccggtgt ctttcagctc gttcatggac atgcacgaca acgagccgat gacagcgatg 1080

gtgaagaagg actgggggga acggtttcaa gttctcaagg atctgacctt tcatttagtg 1140

ggagccaatg gtttatcctt caacgaagac gtggtcgagg agtattttaa atttaaggga 1200

tatgttttgt ataatcacga ggattctgga tccttggcaa atgtacttga gaatggcata 1260

tttttgtacg cagcaacttc acatccttct gagaacgtga ctttgactgc taattgtcgt 1320

gtttattttt atgacgcaga ataagtaata aagtttataa ttttttttac agattaagtt 1380

gaatgttttc aaggagaaaa aaagataaaa aggatgccgg aagctctcga cgattggacg 1440

atcatacctc tggatgggag tccccacagt caggaggata tgaatccgga tccgttagat 1500

ctaattatgg tacagatgga agagataatt cacaatctga atttaataga acagagattg 1560

aacgtgcagt tagagctgtt atccctgtta ctgggtcggg agttttgtcc cagccagaac 1620

agtggcaaag acccagtaga tcattacggg aagcacaaca aagagaagaa agacttaaag 1680

aaacgcagag gagattagat gaggaatttg aaaaggttgt tttttcatta ataattttaa 1740

tagaatttat cactagcaga catgtaataa actagtacat tatcatcgaa ccatggttta 1800

agtgtacttg ccatccgtac aacccaatcc atgtcttcat taactaatac aatacaagga 1860

attccgccac taatacgaaa atccttcata tacttgccct taagaataat atctttttga 1920

gcacctaata atgatttaaa ccaagaagta ctaatcttct cgtattcaat atcatctatt 1980

acattatata acgcaaaatc atcataatct aaaaaactta aactaccggt aaaataattg 2040

tgtctcccta aagatctggc ccattgcgtc ttgccggatc tggttggtcc acagatgtag 2100

aggctgatgg gcctgtctgg cttggactcg ggctcctgtt gcacatatat tgttgtggaa 2160

cagttaggcc cacttcccac caaaaatcat catgacatct ataacataaa acagaatcgg 2220

cccattgacg acttacgaat agaatattgt ccttggccca ttgctgaata ggttcaggta 2280

ggcccgggaa gtcagtccac cggggaacgt aaggaatact tcttcggcgg taatggtctc 2340

gagcgaaacc ggtaatcgac ggccatctga gaacgtagtc ctgtggtctt cgttctcgga 2400

caagggcgag gaaggactcc tcgtctgttg ccaaggtaag gatctctcca aagatcttct 2460

cagcgcttgc aacaggactt cgtcctcgtg tattaaattc tccgtgttca atgaagtgac 2520

cctccttctg gatatatttc ctgacggccg ctggtgagga gcacttctgg acattcggat 2580

ggtaggtgcc cgaggagtgt tcctgcggca aatcaaagaa attaggattt cttgtttcta 2640

gttttttgtc caattggaca atagcatgaa aatgactgtt gtcatcttta tgtttttctt 2700

cagcgacaca ggcatacttg actgtgtatg aattaagaat ttggagtaaa tgggacatga 2760

cccaagtaat agattcggga cattgaggga atgtaaggaa aacattctta gcagccaacc 2820

tgaagttaga acttgaagcc atttatagaa gggaaggagt tgaagccgta cgaagaaggg 2880

agagtaaggt tctataggta aggagggagt ggtggcagcg gcaaatgaag cgagggggcc 2940

ttatataata tt 2952