副溶血性弧菌特异性结合的多肽v2及其应用
本专利申请发明专利，发明名称:副溶血性弧菌特异性结合的多肽V2及其应用和副溶血性弧菌特异性结合的多肽及其用途、为分案申请，原申请号2018105138105、申请日为2018-05-25发明名称：副溶血性弧菌特异性结合的多肽及其用途的分案申请。
技术领域
本发明属于生物
技术领域
，具体涉及一种副溶血性弧菌特异性结合的多肽V2，包括所述多肽在检测副溶血性弧菌中的应用。技术背景
副溶血性弧菌是一种嗜盐性弧菌，存在于近海的海水、海底沉积物和鱼类、贝类等海产品或盐腌渍品中，它是我国沿海地区最为常见的一种食源性致病菌，主要引起急性胃肠炎甚至败血症。据我国食源性疾病监测网的数据显示，近十年来由副溶血性弧菌引起食物中毒的发生规模以及人群暴露规模呈明显上升趋势，已经超过沙门氏菌，成为我国首要的食源性致病菌。因而加强对食品中副溶血性弧菌的快速准确检测，实施食品安全监控，对预防由副溶血性弧菌引起的食品安全事件十分必要。
近年来，免疫磁珠分离技术迅速发展起来，其原理是以抗体包被的磁珠为载体，与反应介质中的特异性抗原结合，形成抗原-抗体复合物，此复合物在外加磁场的作用下发生定向移动，从而特异性捕获分离抗原。在食源性致病菌的检测方面，免疫磁珠分离技术有效结合抗原-抗体反应的特异性和磁珠的磁场响应性，可实现从复杂基质中对目标菌的快速分离和富集，能够有效消除基质干扰，从而提高检测效率，是有效的样品前处理方法，具有较好的开发应用前景。
噬菌体展示技术是将不同排列氨基酸组成的具有各种各样局部三维空间结构的多肽分别展示在噬菌体表面构成分子文库，利用病原体与噬菌体上的相应多肽特异结合的特性，进行生物淘洗，获得能够特异性识别病原体的多肽。此种方法获得的噬菌体特异性多肽既具有单克隆抗体特异性的优点，同时又克服了单克隆抗体制备繁琐的缺点，制备耗时短，并且能够进行大量的制备，大大的节约了时间和成本。因此，筛选出副溶血性弧菌特异性结合的多肽，将其与磁珠偶联形成免疫磁性复合物，可实现对食品中的副溶血性弧菌的快速富集与分离，从而可有效缩短检测时间，提高检测的准确性。
发明内容
本发明的目的是为了对食品中的副溶血性弧菌的快速富集与分离，缩短检测时间，提高检测的准确性，而提供一种副溶血性弧菌特异性结合的多肽。
副溶血性弧菌特异性结合的多肽，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1、2或3所示。
所述的副溶血性弧菌特异性结合的多肽在制备检测副溶血性弧菌试剂中的应用。
一种检测副溶血性弧菌试剂盒，它包括：噬菌体免疫磁性复合物；所述的噬菌体免疫磁性复合物是由下述方法制备的：
1. 洗涤链酶亲和素磁珠：震荡重悬磁珠，用移液器移取100 µL磁珠于反应管中，磁性分离，用移液器吸去上清液；用1 m LPBST洗涤充分震荡重悬，磁性分离，移去上清液，重复洗涤共三次；
2. 合成免疫磁性复合物，具体操作如下：取洗涤好的磁珠100 μL/管，弃去上清后加入4 μg多肽修饰的生物素，用PBST将溶液定容至1 mL，置于垂直混合仪上在室温旋转混合60min，磁珠上修饰的链酶亲和素与多肽上修饰的生物素得以结合，将多肽偶联在磁珠表面，通过磁吸分离法获取上清；
3. 洗涤免疫磁性复合物：用1 mLPBST充分震荡重悬，磁性分离，移去上清液，再用1 mLPBST重悬免疫磁性复合物，重复洗涤共三次，获得的免疫磁性复合物4℃保存备用；
所述的多肽，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1、2或3所示。
本发明提供了副溶血性弧菌特异性结合的多肽V2及其应用，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1、2或3所示；它的有益效果是：（1）将噬菌体展示技术筛选出的与副溶血性弧菌特异性结合的多肽，并制备合成免疫磁性复合物为国内外首次报道；（2）利用本发明提供的免疫磁性复合物富集效率高达93.52%；（3）利用本发明提供的免疫磁性复合物可在30min内实现对副溶血性弧菌的分离富集，相较于传统的培养富集方法，大大的节约时间。
附图说明
图1是ELISA鉴定多肽V1~3对应单克隆噬菌体与副溶血性弧菌的亲和力结果；
图2是三种不同噬菌体多肽免疫磁性复合物富集效率的结果；
图3是不同用量的免疫磁性复合物V1富集效率的结果；
图4是免疫磁性复合物V1不同富集时间的富集效率的结果。
具体实施方式
实施例1主要实验材料：
随机七肽噬菌体展示文库（Ph.D.TM Phage Display Libraries）从NEB公司购买；链酶亲和素磁珠（BeaverBeadsTM Streptavidin）从海狸生物医学工程有限公司购买。
实验试剂：
低盐LB培养基：2 g胰蛋白胨，1 g酵母提取液，1 g NaCl，200 mL双蒸水，高压灭菌，4℃贮存；LB-Tet平板：2 g胰蛋白胨，1 g酵母提取液, 1 g NaCl, 3 g琼脂粉，200 mL双蒸水，高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1 ml四环素贮液（10 mg/ml），混匀倒平板，4℃避光贮存；LB/IPTG/Xgal平板：2 g胰蛋白胨，1 g酵母提取液，1 g NaCl，3 g琼脂粉，200 mL双蒸水，高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1 ml IPTG/Xgal，混匀倒平板，4℃避光贮存；顶层琼脂：2 g胰蛋白胨，1 g酵母提取液，1 g NaCl，0.2 g MgCl2·6H2O，1.4 g琼脂粉，200 mL双蒸水，高压灭菌，4℃贮存；包被液：0.1 M NaHCO3(pH 8.6)，过滤灭菌，室温保存；封闭液：0.1 M NaHCO3(pH 8.6)，5 mg/ml BSA，过滤除菌，4℃贮存。TBS：50 mM Tris-HCl(pH 7.5)，150 mM NaCl，高压灭菌，室温贮存。TBST：第一轮配制0.1% [v/v] Tween-20，第二三轮配制0.5% (v/v) Tween-20；洗脱液：0.2M Gly-HCl(pH 2.2)，0.1％BSA；中和缓冲液：1 M Tris-HCl (pH 9.1)；PEG/NaCl；20% (w/v) PEG-8000，2.5 M NaCl，高压灭菌，室温贮存；NaI缓冲液：10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，0.1 mM EDTA，4 M NaI。
实施例2副溶血性弧菌特异性结合的多肽的筛选和制备
副溶血性弧菌特异性结合的多肽的筛选
按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的循环进行，经过3轮的筛选，具体操作如下：
1. 取100 µL/孔2×107 CFU/mL的副溶血性弧菌加入酶标板中，4℃包被过夜；
2. TBST洗板三次，取300 µL/孔封闭液室温静置封闭90min；
3. TBST洗板六次，将噬菌体肽库稀释至2×1010，100 µL/孔加入酶标板中，室温轻震结合45min；
4. TBST洗板十次，吸尽残液，加入洗脱液100 µL/孔，室温轻震洗脱8min，立即用移液器转移至预置15 µL中和缓冲液的离心管中，混匀；
5. 噬菌体滴度测定：准备LB/IPTG/Xgal平板37℃预温，顶层琼脂3 mL/管49℃预温，洗脱下来的噬菌体用LB做10倍比稀释，将对数生长中期ER2738分装200 µL/管，每管加10 µL噬菌体，快速震荡混匀室温温育5min，加入顶层琼脂中快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板中，适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开，待平板冷却5 min后，倒置于37℃培养过夜，计数有10~102个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 µl噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度；
6. 噬菌体扩增：将洗脱下来的噬菌体80 µL加入到20 mL对数生长前期的ER2738中，37℃摇床培养4.5小时，培养物转入离心管中，4℃10000 rpm离心10min，上清转入新管中再离心。用移液器将80%的上清转入新鲜离心管，加入1/6体积PEG/NaCl，沉淀过夜；
7. 对扩增后的噬菌体再进行滴度测定，以便进行下一轮淘选程序时噬菌体库稀释的依据；
步骤1到7为第一轮淘选和扩增，第二轮和第三轮的淘选和扩增步骤同上，并通过降低靶分子的浓度来提高淘选的严格程度，因此第二轮副溶血性弧菌的包被浓度为1.5×107 CFU/mL，第三轮副溶血性弧菌的包被浓度为1×107 CFU/mL。
整个淘选过程的洗脱噬菌体和扩增后噬菌体的个数如表1所示，回收率逐渐升高，说明亲和筛选效果较好。
表1副溶血性弧菌结合的噬菌体展示多肽的淘选情况
轮数
投入量（pfu）
产出量（pfu）
回收率
1
2ⅹ10<sup>10</sup>
3.12×10<sup>4</sup>
1.56×10<sup>-6</sup>
2
2ⅹ10<sup>10</sup>
2.57×10<sup>5</sup>
1.29×10<sup>-5</sup>
3
2ⅹ10<sup>10</sup>
3.70×10<sup>6</sup>
1.85×10<sup>-4</sup>
实施例3噬菌体克隆的筛选及多肽序列的测定
噬菌体克隆的筛选及其展示多肽序列的测定
在完成最后一次淘选之后，对洗脱液进行滴度测定，选择蓝色噬斑少于100个的LB/IPTG/Xgal平板，随机挑取10个克隆用于扩增和鉴定。操作过程如下：按上述方法进行噬菌斑扩增，在第一步离心后，将500 µl含噬菌体上清转入一新鲜离心管，加200 µl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10 min；4℃10000 rpm离心10min，弃上清，再短暂离心，小心吸去残余上清，沉淀物彻底重悬于100 µl碘化物缓冲液中，再加入250 µl乙醇；室温温育10min；4℃10000 rpm离心10min，弃上清；70％乙醇清洗沉淀，短暂真空干燥；沉淀重悬于30 µl TE缓冲液中，送至上海生工生物工程股份有限公司采用-96引物进行测序。
表2噬菌体展示多肽的核苷酸序列和氨基酸序列
SEQ ID NO
核苷酸序列
氨基酸序列
出现频率（%）
V1
CCAGCAGGCGGAAGCCGCGGCAT
MPRLPPA
44.45
V2
CCCGAAACAACAGTATTCCAATG
HWNTVVS
33.34
V3
CCCGAAGAAACCACCGTCTCCAG
LETVVSS
22.22
用酶联免疫分析法检测噬菌体克隆对副溶血性弧菌的结合，具体操作如下：
（1）包被：用无菌NaHCO3稀释副溶血性弧菌100 µl/孔，4℃孵育包被过夜；
（2）封闭：用洗涤液TBST（0.05%Tween20）洗板6次，吸水纸拍干，加入1%BSA封闭液300 µL/孔，4℃封闭2小时；
（3）用洗涤液TBST洗板6次，吸水纸拍干，对扩增后的噬菌体储备液稀释至1010 pfu，100 µL/孔加入，室温轻微震荡1小时，并设置阴性对照；
（4）用洗涤液TBST洗板6次，吸水纸拍干，加入1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体，室温轻微震荡1小时；
（5）显色：加入显色液100 µL/孔，室温避光显色15min；
（6）终止：加入终止液50 µL/孔；
（7）吸光度测定：用酶标仪测定450nm波长处的各孔吸光值。
结果以P/N＞2.1为判定标准，三种多肽对应的噬菌体克隆均为阳性，故将其氨基酸序列送至上海生物工程有限公司合成纯度为95%的多肽，并修饰以生物素。
实施例4噬菌体免疫磁性复合物的制备
1. 洗涤链酶亲和素磁珠：震荡重悬磁珠，用移液器移取100 µL磁珠于反应管中，磁性分离，用移液器吸去上清液；用1 m LPBST（0.05%Tween20，PH7.4） 洗涤充分震荡重悬，磁性分离，移去上清液，重复洗涤共三次；
2. 合成免疫磁性复合物，具体操作如下：取洗涤好的磁珠100 μL/管，弃去上清后加入4 μg展示多肽，用PBST将溶液定容至1 mL，置于垂直混合仪上在室温旋转混合60min，磁珠上修饰的链酶亲和素与多肽上修饰的生物素得以结合，将多肽偶联在磁珠表面，通过磁吸分离法获取上清；
3. 洗涤免疫磁性复合物：用1 mLPBST充分震荡重悬，磁性分离，移去上清液，再用1 mLPBST重悬免疫磁性复合物，重复洗涤共三次，获得的免疫磁性复合物4℃保存备用。
实施例5
噬菌体免疫磁性复合物对副溶血性弧菌的富集效率测定，具体操作如下：
（1）三种免疫磁性复合物的富集效率测定：副溶血性弧菌单克隆菌落于高盐LB培养液中增菌2小时至对数生长期，取1 ml菌液进行1000倍稀释，将稀释的菌液100 µl加于1.5mL反应管中，加入200 µl上述制备的免疫磁性复合物，再分别加入700 µl PBST，并设置阳性对照为单纯菌液；将反应管置于旋转混悬仪上，室温旋转混合60min，对菌液中的副溶血性弧菌进行富集；反应结束后，将磁吸分离取得的上清进行平板计数。
三种多肽VI、V2、V3与磁珠偶联的免疫磁性复合物的富集效率分别为93.03%，83.97%，79.79%，多肽V1的免疫磁性复合物富集效率最高，并对其富集副溶血性弧菌的条件进行优化：
（1）优化免疫磁性复合物V1的用量：副溶血性弧菌单克隆菌落于高盐LB培养液中增菌2小时至对数生长期，取1 ml菌液进行1000倍稀释，将稀释的菌液100 µl加于1.5 mL反应管中，分别加入100 µl、200 µl、300 µl、400 µl、500 µl、600 µl免疫磁性复合物V1，再分别加入800 µl、700 µl、600 µl、500 µl、400 µl、300 µlPBST，使体系均为1ml，并设置阳性对照为单纯菌液；将反应管置于旋转混悬仪上，室温旋转混合60min，对菌液中的副溶血性弧菌进行富集；反应结束后，将磁吸分离取得的上清进行平板计数。
最佳的免疫复合物的用量为300 µl，即1 ml 的反应体系所用磁珠300 µg，多肽12 µg。
（2）优化免疫磁性复合物V1的富集时间：副溶血性弧菌单克隆菌落于高盐LB培养液中增菌2小时至对数生长期，取1 ml菌液进行1000倍稀释，将稀释的菌液100 µl加于1.5mL反应管中，加入300 µl上述制备的免疫磁性复合物，再分别加入600 µl PBST，使反应体系为1 ml，并设置空白对照；将反应管置于旋转混悬仪上，室温分别旋转混合15min、30min、45min、60min、90min、120min，对菌液中的副溶血性弧菌进行富集；反应结束后，将磁吸分离取得的上清进行平板计数。
最佳富集时间为30min。
本发明制备的噬菌体多肽免疫磁性复合物对副溶血性弧菌的富集效率高，富集时间短，可实现对副溶血性弧菌的快速富集分离，是很好的样品前处理方法，为建立高效简便的检测体系奠定了基础。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 副溶血性弧菌特异性结合的多肽V2及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
ccagcaggcg gaagccgcgg cat 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
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<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
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