两种基于低共熔体系的纤维素液体化制备通用微生物培养基的方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，涉及基于低共熔体系的纤维素液体化制备通用微生物培养基的方法，具体地，涉及制备碳源的方法、碳源、新型的微生物培养基及微生物的培养方法。
背景技术
培养基是微生物生长代谢的主要场所，工业生产中所使用的培养基通常被称为发酵培养基或者工业培养基。基本成分一般包括碳源、氮源、无机盐、水分和生长因子，其中碳源是满足微生物生长繁殖所需碳元素的营养源，也是微生物生长需要量最大的营养物。微生物利用的碳源范围及其广泛，在工业培养基中碳源的选择需根据微生物生长特点和生产要求，同时也需考虑到工业培养基在大规模生产中的经济效益与环保要求。近些年来，随着环保产业的不断升级，政策的不断推出，农业废弃物的综合利用再不断加强。其中将富含纤维素的秸秆用做工业培养基的碳源，是一种既符合经济效应，也满足环保要求的策略。
工业中使用的碳源大多以碳水化合物为主，可依据利用优先顺序分为速效碳源和迟效碳源，常见速效碳源就是葡萄糖，而迟效碳源则是玉米淀粉、麸皮、马铃薯等大多数谷物产品和富含淀粉的物质。纤维素相较于这些发酵工业中常使用的碳水化合物，并不能被大多数工业菌株所利用，仅部分具有纤维素降解通路的菌株可将纤维素降解为单糖去利用。而在大规模液体摇瓶发酵中，纤维素因难以在水相和有机相中形成稳定溶液，即便是具有纤维素降解通路的菌株也难在液体摇瓶中进行大量增殖。但纤维素的优点也显而易见，纤维素来源极为广阔，是地球上最古老、最丰富的天然高分子化合物，是人类最宝贵的天然可再生资源，麻、麦秆、稻草、甘蔗渣等农业废弃物都是纤维素的丰富来源。目前在许多发达国家出于对经济效益与环保要求的考量，都在加强对这些农业废弃物中纤维素的利用，部分国家和地区已形成了完整产业，在生物乙醇生产、造纸、塑料加工等方面皆有应用。同时纤维素相较于葡萄糖、淀粉等工业常用碳水化合物，价格成本低，每年在农业生产中都会产生大量的纤维素，若能将其作为工业培养基的廉价碳源，加以充分利用，将会为全球可持续发展做出很大的贡献。
天然纤维素结晶度高，纤维素结构规整，具有致密的晶体结构，大分子葡萄糖基环中带有的醇羟基，会形成键能极强的氢键作用，使纤维素难溶于水等其他常规有机溶剂中，只能溶于碱性或高浓度的无机酸溶液中。这样使得许多工业微生物无法利用纤维素进行生产。纤维素的化学性质比较稳定，在特定条件下纤维素能被氧化、酯化和醚化，在一定程度上也能被酸和酶降解。而通过有效的预处理破坏其结构是其可被众多微生物利用的关键因素。20世纪60年代，由于PF/DMSO溶解能力特别强，人们尝试使用它作为纤维素的良溶剂，但该溶剂有毒且回收较困难，不利于环境保护。NaOH/CS2体系则是将一定量的 CS2通入碱处理后的纤维素,形成黄原酸纤维素酯，这种酯可溶于氢氧化钠，此溶解体系工艺过程繁琐，且对环境污染也很大。除此之外，质子酸体系也是溶解纤维素的一种方法,一般用于生产纤维素衍生物，但是由于生产过程中易产生CS2和氨等有毒残留物质，对环境污染严重，使其发展受到限制。另外，氨基甲酸酯体系是将尿素与NaOH处理后的纤维素混合并加入惰性溶剂，产生氨基甲酸酯，这种方法虽然比较环保，但是过程复杂，且有杂质生成，无法得到广泛应用。近年来，N-甲基吗啉水溶液(NMMO·H2O)是最具代表的有机溶剂，该体系溶解效率较高，且不会发生降解，但是NMMO的价格昂贵，无法直接应用于工业生产。
因此，有待探索、优化更加方便、高效、环保的处理纤维素用于微生物培养的方法，使纤维素能够得到更加广泛的应用。
发明内容
本申请是基于发明人对以下问题的发现和认识作出的：
通过离子液体(Ionic liquid，IL)和氢氧化钠(NaOH)/尿素(Urea)溶液体系可将纤维素进行液体化，而液体化后的纤维素可以广泛用于工业生产，发明人将液体化后的纤维素进行分馏，惊喜地发现，分流后的纤维素液体可以构建新型广谱培养基，且在合理的条件下离子液体可以被高效回收并进行循环利用。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种制备碳源的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)将离子液体与纤维素进行第一混合处理，所述离子液体预先进行加热处理；2)将步骤1)所得混合液与蒸馏水进行第二混合处理；3)将步骤2)所得混合液进行过滤处理；4)将步骤3)所得滤液进行蒸馏水定容处理，以获得所述碳源。根据本发明实施例，将所述离子液体预先进行预热处理相比于直接将所述离子液体与纤维素共同加热，所得碳源中纤维素溶解更加充分，利用本方法获得的碳源所制备的培养基进行微生物培养，培养的菌株可进行增殖，且生长状态良好。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述预热处理后的离子液体的温度为70℃～90℃。根据本发明实施例，将所述预热温度为70℃～90℃时，离子液体可实现完全熔化。
根据本发明的实施例，将所述离子液体与纤维素以5：3～10：1质量比进行第一混合处理。根据本发明的实施例的质量比进行第一混合处理时，所添加的离子液体可完全溶解所添加的纤维素，混合体系呈现为液态，不含有粘稠或片状纤维素。
根据本发明的实施例，将步骤1)所得混合液与蒸馏水以1：2的体积比进行第二混合处理。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括对步骤4)所得定容产物进行分馏处理，以便获得不含离子液体的碳源和第一次回收的离子液体。分馏处理使得碳源和有毒的离子液体进行分离，微生物在不含离子液体的碳源制备的培养基中增殖速度加快。
根据本发明的实施例，所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑氯盐。根据本发明实施例， 1-丁基-3-甲基咪唑氯盐相比于离子液体1-丁基-3-甲基咪唑硼酸盐、1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐溶解纤维素更加完全、溶解时间显著缩短。
根据本发明的实施例，所述第一混合处理是通过如下方式进行的：1)将离子液体与纤维素混合液在100℃～140℃条件下进行第1次搅拌处理；2)将第1次搅拌处理后的混合液体在150℃～200℃进行第2次搅拌处理；3)重复步骤2)3次。根据本发明的实施例所述的温度进行加热处理，并且伴随连续搅拌处理，大大缩短了纤维素的溶解时间，提高了溶解效率。
根据本发明的实施例，所述定容按照添加离子液体质量:定容体积为1g：60mL～1g： 30mL的比例进行。根据本发明的实施例的定容比例，利用所述含离子液体的碳源制备培养基时，培养基内离子液体浓度较低，微生物可正常增殖，生长状态良好。
根据本发明的实施例，所述定容按照离子液体质量：定容体积为1g：50mL的比例进行。根据本发明的实施例的定容比例，利用所述含离子液体的碳源制备培养基时，培养基内离子液体浓度及碳源浓度均符合微生物的生长要求，微生物可正常增殖，生长状态良好。
根据本发明的实施例，所述定容按照溶解纤维素质量:定容体积为1g：50mL～1g：30mL 的比例进行。
根据本发明的实施例，所述定容按照溶解纤维素质量:定容体积为1g：40mL的比例进行。根据本发明实施例，当定容比例溶解纤维素质量:定容体积为1g：40mL时，利用所述不含离子液体的碳源制备培养基时，培养基内碳源浓度最佳，微生物的生长状态良好。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：1)将加热后的第一次回收的离子液体与纤维素按照5：3～10：1的质量比进行第三混合，所述加热后的第一次回收的离子液体的温度为100℃～140℃；2)将第三混合处理后液体在150℃～200℃进行搅拌处理；3)重复步骤2)2次；4)将步骤3)所得混合液与蒸馏水以1：2的体积比进行第四混合；5)将第四混合处理产物进行过滤处理；6)将步骤5)所得滤液进行蒸馏水定容处理；7)对定容处理产物进行分馏处理，以获得所述碳源和第二次回收的离子液体。根据本发明实施例所述的方法，第一次回收的离子液体与纤维素在100℃～140℃、150℃～200℃的微波加热中仍然可完全溶解所添加的纤维素，溶解后的混合体系呈现为液态，不含有粘稠或片状纤维素。
根据本发明的实施例，所述分馏处理是在如下条件进行：真空压强：-0.070Mpa～-0.095Mpa、第一次水浴温度：20℃～50℃、第二次水浴温度：55℃～80℃、转速：40rpm～70rpm。根据本发明实施例，所述分馏处理可以很好的将离子液体与碳源进行分离，所得碳源中不含离子液体。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种碳源。根据本发明的实施例，所述碳源是通过第一、第二方面所述方法获得的。利用所述碳源制备的培养基所培养的微生物可增殖，且生长状态良好。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备培养基的方法。根据本发明的实施例，所述方法是向第二方面所述的碳源中加入NH4Cl、MgSO4、NaCl，使得NH4Cl的终浓度为2g/L、MgSO4的终浓度为0.2g/L、NaCl的终浓度为10g/L。根据本发明的实施例所述方法和比例获得的培养基所培养的微生物生长状态良好。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，所述培养基是利用第三方面所述的方法获得的。利用所述培养基培养的微生物可进行增殖，且生长状态良好。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种培养微生物的方法，所述方法包括：将微生物在第四方面所述的培养基中进行培养处理。根据本发明实施例的方法可培养多种微生物，微生物可进行增殖，且生长状况良好。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述培养是在37℃、150rpm条件下进行的。根据本发明的实施例，采用第四方面所述的培养基于37℃、150rpm条件下可培养多种微生物，微生物可进行增殖，且生长状态良好。
根据本发明的实施例，所述微生物包括乳酪短杆菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、阴沟肠杆菌、盐单胞菌、大肠杆菌中的至少之一种。根据本发明的实施例，所述微生物培养方法可培养的微生物种类不受特别限制，可在第四方面所述的培养基和37℃、150rpm条件下进行增殖的微生物均可采用所述方法进行培养。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种制备碳源的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)将所述碱性混合液体1与纤维素混合以50mL：1g～200mL：1g的比例混合，以获得碱性混合液体2，所述碱性混合液体1包括氢氧化钠和尿素；2)将所述碱性混合液体2在-10℃～-80℃下进行冷冻处理24h；3)将冷冻处理后的碱性混合液体2进行升温处理；4)将升温至0℃～-20℃的碱性混合液体2进行pH回调处理，获得碱性混合液体 3；5)将pH回调为7～11的所述碱性混合液体3进行过滤处理，以便获得滤液，所述滤液构成所述碳源。根据本发明实施例，利用所述方法获得的碳源可制备成培养基培养多种微生物，且微生物生长状态良好。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述碱性混合液体1中包括质量比为3％～8％氢氧化钠以及质量比为6％～14％的尿素。
根据本发明的实施例，所述碱性混合液体1中包括质量比为3％～5％氢氧化钠以及质量比为6％～10％的尿素。根据本发明实施例的氢氧化钠和尿素添加比例，纤维素可得到更加充分的溶解。
根据本发明的实施例，所述碱性混合液体1中包括质量体积比为4％氢氧化钠以及质量体积比为7％的尿素。根据本发明的实施例的氢氧化钠和尿素添加比例，将所得呈冰水状的 NaOH/Urea-微晶纤维素溶液进行搅拌后逐渐澄清，纤维素被完全溶解。
根据本发明的实施例，第一、第六方面所述纤维素为固体纤维素。根据本发明的实施例，所述固体纤维素不受特限制，可为纯化后的纤维素或混合物。
根据本发明的实施例，所述纤维素为微晶纤维素。根据本发明实施例，所述微晶纤维素不受特别限制，所有以β-1,4-葡萄糖苷键结合的直链式多糖类物质均可使用。
根据本发明的实施例，所述纤维素为农业废弃物秸秆。根据本发明的实施例，所述纤维素的种类不受特别限制，任何含有纤维素的农业废弃物秸秆均可用来生产第一、第六方面所述的碳源及培养基，如：甘草、小麦、玉米、高粱、棉花、水稻秸秆以及废弃苹果树、桃树等含有纤维素的物质。
根据本发明的实施例，所述纤维素为甘草秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆、高粱秸秆、棉花秸秆中的至少之一种。根据本发明的实施例，采用稀酸进行pH回调处理。
根据本发明的实施例，所述稀酸为HCl。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种碳源。根据本发明实施例，所述碳源是通过第五方面所述方法获得的。利用所述碳源制备成新型广谱培养基培养的微生物生长状态良好。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种制备培养基的方法。根据本发明的实施例，所述方法是向第七方面所述的碳源中加入NH4Cl、MgSO4、NaCl，使得NH4Cl的终浓度为2g/L、MgSO4的终浓度为0.2g/L、NaCl的终浓度为10g/L。根据本发明的实施例，所述方法获得的培养基所培养的微生物生长状态良好。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明实施例，所述培养基利用第八方面所述的方法获得。根据本发明的具体实施例，利用所述培养基培养的微生物生长状态良好。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种培养微生物的方法，所述方法包括：将微生物在权利要求20所述的培养基中进行培养处理。根据本发明的实施例，所述方法可培养多种微生物，微生物可进行增殖，接种菌株可在培养基中进行PHA的积累。
根据本发明的实施例，所述培养是在35℃～37℃、145rpm～155rpm条件下进行的。根据本发明的实施例，采用第九方面所述的培养基于37℃、150rpm条件下可培养多种微生物，微生物可进行增殖，且生长状态良好。
根据本发明的实施例，所述微生物为耐盐碱菌株。根据本发明的实施例，所述微生物培养方法可培养的微生物种类不受特别限制，耐盐碱菌株均可用所述方法进行培养。
根据本发明的实施例，所述微生物包括乳酪短杆菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、阴沟肠杆菌、盐单胞菌、大肠杆菌中的至少之一种。根据本发明的实施例的方法，乳酪短杆菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、阴沟肠杆菌、盐单胞菌、大肠杆菌均可进行生长、增殖。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1是根据本发明实施例的乳酪短杆菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、盐单胞菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌在液体纤维素作为碳源的培养基中的生长曲线结果图；
图2是根据本发明实施例的乳酪短杆菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、大肠杆菌在甘草秸秆液体化后作为碳源的培养基中的生长曲线结果图；
图3是根据本发明实施例的NaOH/Urea溶液对纤维素进行液体化实验中纤维素最大溶解量的结果图；
图4是根据本发明实施例的微晶纤维素溶解量为响应值绘制纤维素测试值与预测值的二维等高线图；
图5是根据本发明实施例的微晶纤维素溶解量为响应值绘制纤维素测试值与预测值的三维响应曲面图；
图6是根据本发明实施例的NaOH/Urea体系处理微晶纤维素后纤维素在碱性溶液中的结构变化图；
图7是根据本发明实施例的NaOH/Urea体系处理微晶纤维素后加HCl回调析出的滤渣的结构变化图；
图8是根据本发明实施例的NaOH/Urea体系处理微晶纤维素后加HCl回调析出的滤液中纤维素的结构变化图；
图9是根据本发明实施例的NaOH/Urea体系处理微晶纤维素后获得的纤维素液体作为碳源培养藤黄微球菌72h后菌株的形态；
图10是根据本发明实施例的NaOH/Urea体系处理微晶纤维素后获得的纤维素液体作为碳源培养藤黄微球菌72h后藤黄微球菌细胞干重、培养基pH值、培养基碳源变化图；
图11是根据本发明实施例的NaOH/Urea体系处理微晶纤维素后获得的纤维素液体作为碳源培养藤黄微球菌72h后，相关PHA GC检测结果图。图11-A为氯仿样品色谱结果，第一个色谱峰为氯仿溶液，保留时间2.658min，图11-B为PHA标准样品酯化后色谱结果，第一个色谱峰为3HB，保留时间为2.284min,第二个色谱峰为氯仿，保留时间为2.681 min；图11-C为藤黄微球菌冻干菌体酯化后色谱结果，其中第一个峰保留时间为2.287min 与标准品3HB保留时间基本一致,该色谱峰为藤黄微球菌胞内3HB。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
微晶纤维素是一种纯化的、部分解聚的纤维素，白色、无臭、无味，由多孔微粒组成的结晶粉末，主要成分为以β-1,4-葡萄糖苷键结合的直链式多糖类物质。聚合度约为 3000～10000个葡萄糖分子。在一般植物纤维中，微晶纤维素约占73％，另30％为无定形纤维素。
本发明的目的是通过离子液体和NaOH/Urea溶液体系，两种方式预处理纤维素，使其液体化，并以此为碳源，构建新型广谱培养基以及回收离子液体。发明人对预处理纤维素的离子液体、离子液体的浓度、离子液体与纤维素的添加比例、离子液体分解纤维素的温度进行筛选，以获得最佳的离子液体溶解纤维素的实验条件；同时，发明人对NaOH/Urea 溶液体系中的NaOH和Urea的浓度、NaOH/Urea溶液与纤维素添加比例、NaOH/Urea溶液预处理纤维素的温度进行筛选，以获得最佳的NaOH/Urea溶液预处理纤维素的实验条件；将最佳溶解纤维素条件下获得的碳源经过一定倍数的稀释，利用所述碳源制备成广谱微生物培养基并验证所述广谱培养基的培养能力。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
(1)利用离子液体预处理纤维素，经过滤、定容过程，利用定容混合液体作为碳源，构建新型培养基培养细菌或利用离子液体预处理纤维素，经过滤、定容、分馏等过程，回收旋转蒸发仪蒸发瓶中的离子液体，利用旋转蒸发仪收集瓶中的无色透明液体作为碳源，构建新型培养基培养细菌；利用回收的离子液体继续进行如上步骤。
(2)利用NaOH/Urea溶液体系预处理纤维素，经冷冻、融化、搅拌、调整pH、过滤等过程，利用滤液为碳源，构建新型培养基培养细菌。
为实现制备以离子液体预处理过的纤维素为碳源的培养基和回收离子液体的目的，本发明采用如下技术方案：
(1)离子液体加热至70℃～90℃，与纤维素按照5:3～10:1的质量比混合，加热至100℃～140℃，停止加热，搅拌。加热至150℃～200℃，停止加热，搅拌(往复3次)。在烧杯中加入2倍体积蒸馏水，搅拌，溶解后使用快速定性滤纸过滤。在滤液中加入蒸馏水定容，定容比例为定容体积mL:溶解纤维素克数＝1:50～1:30，或定容体积mL：溶解纤维素克数＝1:60～1:30，当定容后的混合液体不进行分馏去作为碳源构建培养基时，所得混合液体为含有大量离子液体的碳源，而离子液体是有毒的，因此，为保证微生物的正常生长需对混合液体种的离子液体进行稀释，此时的稀释倍数为添加离子液体质量：定容体积为 1g：60mL～1g：30mL，然后在定容后的混合液体中，按比例添加NH4Cl(2g/L)、 MgSO4(0.2g/L)、NaCl(10g/L)，115℃高压蒸汽灭菌15min。接种菌株，37℃，150rpm下观察OD600变化。当定容后的混合液体进行分馏时，分馏后得到的混合液体为不含离子液体的碳源，为保证微生物的生长应保证培养基种碳源的浓度，此时的稀释倍数为溶解纤维素质量：定容体积为1g：50mL～1g：30mL。
(2)对步骤(1)所得定容后的混合液体溶液进行分馏，真空压强：-0.070Mpa～ -0.095Mpa，第一次水浴加热温度：20℃～50℃，第二次水浴加热温度为55℃～80℃，即沸点产生一次变化，转速：50rpm，分馏结束，收集瓶中可得无色透明液体，该液体为不含离子液体的碳源，回收蒸发瓶中为回收的离子液体，且离子液体可进行多次回收。
(3)在步骤2)获得的不含离子液体的碳源或步骤1)获得的含离子液体的碳源中按比例添加NH4Cl(2g/L)、MgSO4(0.2g/L)、NaCl(10g/L)，115℃高压蒸汽灭菌15min。接种菌株，37℃，150rpm下观察OD600变化。
(4)加热步骤(2)中回收的离子液体，至100℃～130℃，停止加热，与纤维素按照5:3～10:1的质量比混合，加热至140℃～180℃，停止加热，搅拌(往复3次)。在烧杯中加入2倍体积蒸馏水，搅拌，溶解后使用快速定性滤纸过滤。在滤液中加入蒸馏水定容，定容容量mL:溶解克数＝1:30～1:60。
(5)对步骤(4)所得溶液进行分馏，真空压强：-0.070Mpa～-0.095Mpa，第一次水浴加热温度：20℃～50℃，第二次水浴加热温度为55℃～80℃，即沸点产生一次变化，转速：50rpm，分馏结束，收集瓶中可得无色透明液体，回收蒸发瓶中离子液体。
(6)在收集瓶溶液中按比例添加NH4Cl(2g/L)、MgSO4(0.2g/L)、NaCl(10g/L)，110℃高压蒸汽灭菌15min。接种菌株，37℃，150rpm下观察OD600变化。
(7)加热步骤(5)中回收的离子液体，至100℃～130℃，停止加热，与纤维素按照5:3～10:1的质量比混合，加热至140℃～180℃，停止加热，搅拌(往复3次)。在烧杯中加入2倍体积蒸馏水，搅拌，溶解后使用快速定性滤纸过滤。在滤液中加入蒸馏水定容，定容容量mL:溶解克数＝1:30～1:60。
(8)对步骤(7)所得溶液进行分馏，真空压强：-0.070Mpa～-0.095Mpa，第一次水浴加热温度：20℃～50℃，第二次水浴加热温度为55℃～80℃，即沸点产生一次变化，转速：50rpm，分馏结束，收集瓶中可得无色透明液体，回收蒸发瓶中离子液体。
(9)在收集瓶溶液中按比例添加NH4Cl(2g/L)、MgSO4(0.2g/L)、NaCl(10g/L)，115℃高压蒸汽灭菌15min。接种菌株，37℃，150rpm下观察OD600变化。
NaOH/Urea溶液体系预处理的纤维素为碳源的培养基的目的，本发明采用如下技术方案：
(1)将NaOH(3～8％)与Urea(6～14％)混合定容至1000ml，加入5～20g纤维素混合，置于-10℃～-80℃下，预冻24h。
(2)将步骤(1)所得预冻溶液置于室温，溶液升温至0℃～-40℃，此时溶液呈冰水混合状，进行搅拌直至溶液完全溶化，使用HCl回调pH至7～11后，利用纱布进行过滤，收集滤液。
(3)在滤液中按比例添加NH4Cl(2g/L)、MgSO4(0.2g/L)、NaCl(10g/L)，115℃高压蒸汽灭菌15min，接种藤黄微球菌，37℃，150rpm下观察CDW变化。
(4)72h后将培养物转移至50mL离心管中，在12000rpm下离心10min，弃上清，将沉淀物置于-70℃预冻4h后，置于-60℃真空冷冻干燥机中冻干过夜。
(5)取20mg左右冻干的细胞样品，精确(0.0001)称重后放于酯化管中，分别加入2mL。氯仿(AR)和2mL酯化液(500ml/L无水甲醇+1g/L苯甲酸+3％(v/v)浓硫酸)。称取10mg左右标准PHA样品(PHB)，用同样方式处理，制成标准样品的氯仿溶液。密封酯化管，震荡混合均匀后，100℃恒温酯化4h。冷却至室温后，加入1mL ddH2O，震荡至完全混匀后，静置约30min，等待分层。待水相和有机相完全分离后，取下层(氯仿相) 溶液进行GC分析，测算3HB含量。
本发明的实验证明，本发明利用离子液体预处理纤维素，以此为碳源，构建出了一种可以使多株不同种属细菌进行增殖的新型培养基，同时回收到的离子液体保持了一定的原有性能。同时利用NaOH/Urea溶液体系预处理纤维素，以此为碳源，构建出了一种可以使部分细菌进行增殖，同时使菌株积累PHA的新型培养基。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
所用离子液体购自上海成捷化学有限公司，旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂，快速定性滤纸购自杭州特种纸业有限公司，气相色谱仪型号为Agilent Technologies6850，购自安捷伦科技(中国)有限公司，中草药粉碎机购自天津市泰斯特仪器有限公司，NH4Cl、 MgSO4、NaCl、Urea购自天津市北联精细化学品开发有限公司，NaOH、盐酸、无水甲醇、氯仿、浓硫酸购自天津永晟精细化工有限公司，蛋白胨、酵母粉、琼脂购自北京奥博星生物技术有限责任公司，大肠杆菌购自生工生物工程(上海)股份有限公司，乳酪短杆菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、阴沟肠杆菌、盐单胞菌、地衣芽孢杆菌均由新疆大学岳海涛实验组提供，所有培养基如无特别说明均用蒸馏水配制。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1离子溶液的筛选
发明人将不同离子液体(1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、1-丁基-3-甲基咪唑硼酸盐、1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐)预处理纤维素的实验条件进行大范围筛选，目的在于筛选出能够高效溶解纤维素的离子液体，同时对实验条件进行粗略筛选。处理方式包括：1)将离子液体水浴加热后与纤维素按比例混合，继续进行水浴或微波加热，其中，预热离子液体的温度与两者混合后继续加热的温度相同；2)或者将离子液体与纤维素按比例混合，进行共同加热，观察纤维素的溶解程度，记录纤维素溶解时间。具体实验现象及实验结论如表1所示，将1-丁基3-甲基咪唑氯盐于110℃温度下预热至液态后，将其与纤维素以5：3的质量比混合，继续用部分溶解，IL成褐色，气味似焦糖，加入100mL水静置分层，发明人认为该离子液体在上述实验条件下可较好的进行纤维素处理；而其它离子液体预处理纤维素的效果较差或离子液体与纤维素溶解质量比较大、溶解时间长，不建议采用。
表1：
实施例2离子液体与纤维素添加比例、实验温度筛选
根据实施例1的结果，本实施例旨在进一步筛选离子液体(1-丁基-3-甲基咪唑氯盐)与纤维素的混合比例及合适的实验条件。处理方式包括：1)将1-丁基-3-甲基咪唑氯盐微波加热后与纤维素按比例混合，继续进行微波加热；2)或者将1-丁基-3-甲基咪唑氯盐与纤维素按比例混合，共同进行微波加热，加热过程中配合搅拌处理，观察溶解程度，记录溶解时间，具体操作及实验结果如表2所示，处理6～10中的纤维素溶解较充分，离子溶液与微晶纤维素的质量比为5：2～10：1，实验条件为IL加热至90℃，加入纤维素，搅拌20s，继续加热至120℃，搅拌20s，重复加热至120℃以上，当加热至120℃时，体系变黑，有焦糖味，重复加热至180℃，纤维素溶解。
表2：
实施例3微生物培养基中离子溶液浓度筛选
因离子液体具有毒性，若碳源中含有大量离子液体则制备的培养基不利于菌株的生长，因此，本实施例的目的在于筛选培养基中所含离子液体的浓度范围。发明人在LB固体培养基中(酵母粉：10g/L、蛋白胨：5g/L、NaCl：10g/L、琼脂：18g/L)加入不同比例离子液体(1-丁基-3-甲基咪唑氯盐)，涂布大肠杆菌，观察48h生长状态，具体结果如表3所示，当离子溶液浓度为2％时，大肠杆菌正常生长；当离子液体浓度达到3％以上时，大肠杆菌的生长受到抑制，因此，微生物培养过程中培养基内离子溶液浓度不能超过3％。
表3：
实施例4离子液体预处理纤维素作为碳源的新型微生物培养基菌株培养能力验证
本实施例对优化实验条件获得碳源进行应用，将含有液体纤维素碳源的培养基、离子液体回收后所得分馏产物制成的培养基进行功能验证，测定新型培养基对多株不同种属菌株的培养能力。
实验一：
1)利用中药粉碎机粉碎甘草秸秆，过30目筛，得甘草秸秆粉末。离子液体(1-丁基-3- 甲基咪唑氯盐)与甘草秸秆粉末按照5:2的质量比添加，将离子液体加入烧杯，加热至90℃，离子液体完全熔化为透明无色粘稠状液体。往完全熔化的离子液体中加入甘草秸秆粉末，玻璃棒搅拌，加热至120℃，甘草秸秆粉末与离子液体混合物开始变黑，停止加热，搅拌20s。加热至180℃，停止加热，搅拌20s(往复3次)。在烧杯中加入2倍体积蒸馏水，玻璃棒搅拌，溶解后使用快速定性滤纸过滤。在滤液中加入蒸馏水定容以控制碳源中离子液体的浓度，进而控制新型培养基中离子液体的浓度，离子液体质量：定容体积＝1g：50mL。
在上述定容后的溶液中按比例添加NH4Cl(2g/L)、MgSO4(0.2g/L)、NaCl(10g/L)，115℃高压蒸汽灭菌15min。以3％的接种量往其中接种乳酪短杆菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、大肠杆菌(OD600＝0.5～0.6)。37℃、150rpm下摇床培养。通过生长曲线(如图1所示)可知乳酪短杆菌、芽孢杆菌在该培养基中增殖速度较快，生长状态良好，说明该方法处理下得到培养基培养效果良好。
实验二：
1)将离子液体与微晶纤维素按照5:2的质量比添加。将离子液体加入烧杯，加热至90℃，离子液体完全熔化为透明无色粘稠状液体。往完全熔化的离子液体中加入微晶纤维素，玻璃棒搅拌20s。继续加热至120℃，此时微晶纤维素与离子液体混合物开始变黑，停止加热，玻璃棒搅拌20s。继续加热至180℃，停止加热，搅拌20s(往复3次)。在烧杯中加入2 倍体积蒸馏水，玻璃棒搅拌，溶解后使用快速定性滤纸过滤。在滤液中加入蒸馏水定容，溶解微晶纤维素质量：定容体积＝1g：40mL。
2)使用旋转蒸发仪对上步所得溶液进行分馏，压强：-0.080Mpa、第一、二次水浴加热的温度分别为25℃、80℃(沸点产生一次变化)、转速：50rpm，分馏结束后收集瓶中可得无色透明液体，蒸发瓶中可得离子液体。
3)在回收瓶溶液(不含离子液体的碳源)中按比例添加NH4Cl(2g/L)、MgSO4(0.2g/L)、NaCl(10g/L)，115℃高压蒸汽灭菌15min。以3％的接种量往其中接种乳酪短杆菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、阴沟肠杆菌、盐单胞菌、大肠杆菌(OD600＝0.5～0.6)。37℃、150rpm下摇床培养。通过生长曲线(图2)可知乳酪短杆菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、阴沟肠杆菌、盐单胞菌、大肠杆菌可在该培养基中增殖，说明了该种方法处理下得到的培养基具备一定的微生物培养能力。
实验三：
1)将本实施例实验二中回收得到的离子液体与微晶纤维素按照5:2的质量比添加。将离子液体加入烧杯，加热至130℃，往离子液体中加入微晶纤维素，玻璃棒搅拌20s。继续加热至180℃，玻璃棒搅拌20s，往复3次。在烧杯中加入2倍体积蒸馏水，玻璃棒搅拌，溶解后使用快速定性滤纸过滤。在滤液中加入蒸馏水定容，溶解微晶纤维素质量：定容体积＝1g：40mL。
2)使用旋转蒸发仪对上步所得溶液进行分馏，压强：-0.075Mpa，第一、二次水浴加热温度分别为35℃、75℃(沸点会有一次变化)，转速：50rpm，分馏结束后收集瓶中可得无色透明液体，蒸发瓶中可得离子液体。
3)在回收瓶溶液中按比例添加NH4Cl(2g/L)、MgSO4(0.2g/L)、NaCl(10g/L)，115℃高压蒸汽灭菌15min。以3％的接种量往其中接种乳酪短杆菌、大肠杆菌(OD600＝0.5～0.6)。37℃、 150rpm下摇床培养。OD600随时间变化的趋势如表4所示。通过OD600可知乳酪短杆菌、大肠杆菌可在该培养基中增殖，说明了该种方法处理下得到的培养基具备一定的微生物培养能力。
表4：
项目
OD<sub>600</sub> 0h
OD<sub>600</sub> 24h
OD<sub>600</sub> 48h
OD<sub>600</sub> 72h
大肠杆菌
0.0730
0.1465
0.1978
0.1998
乳酪短杆菌
0.0632
0.1525
0.1834
0.1820
实验四：
1)将实验三中回收得到的离子液体与微晶纤维素按照5:2的质量比添加。将离子液体加入烧杯，加热至130℃，往离子液体中加入微晶纤维素，玻璃棒搅拌20s，继续加热至180℃，玻璃棒搅拌20s，往复3次。在烧杯中加入2倍体积蒸馏水，玻璃棒搅拌，溶解后使用快速定性滤纸过滤。在滤液中加入蒸馏水定容，溶解微晶纤维素质量：定容体积＝1g： 40mL。
2)使用旋转蒸发仪对上步所得溶液进行分馏，压强：-0.075Mpa，第一、二次水浴加热温度分别为35℃、75℃(沸点产生一次变化)、转速：50rpm，分馏结束后收集瓶中可得无色透明液体，蒸发瓶中可得离子液体。
3)在回收瓶溶液中按比例添加NH4Cl(2g/L)、MgSO4(0.2g/L)、NaCl(10g/L)，115℃高压蒸汽灭菌15min。以3％的接种量往其中接种乳酪短杆菌、大肠杆菌(OD600＝0.5～0.6)。37℃、 150rpm下摇床培养。OD600随时间变化的趋势如表5所示。通过OD600可知乳酪短杆菌、大肠杆菌可在该培养基中增殖，说明了该种方法处理下得到的培养基具备一定的微生物培养能力。
表5：
项目
OD<sub>600</sub> 0h
OD<sub>600</sub> 24h
OD<sub>600</sub> 48h
OD<sub>600</sub> 72h
大肠杆菌
0.0716
0.1321
0.1821
0.1878
乳酪短杆菌
0.0655
0.1644
0.1964
0.1920
实施例5 NaOH/Urea与纤维素实验温度筛选
本实施例对NaOH/Urea溶液体系处理纤维素的实验条件进行筛选，具体实验条件、操作及实验结果如下：
1)配置4％NaOH/7％Urea溶液，向该溶液中加入1g/L微晶纤维素后，室温下NaOH/Urea-微晶纤维素溶液呈浑浊状态，静置后微晶纤维素沉淀至溶液底部。说明室温下微晶纤维素不溶于该溶液体系。
2)配置4％NaOH/7％Urea溶液，向该溶液中加入14g/L微晶纤维素，-10℃下冰冻处理24h后，置于室温下融化，当溶液升温至-14℃时，溶液呈冰水混合物状态，此时进行搅拌，NaOH/Urea-微晶纤维素溶液逐渐澄清，纤维素被完全溶解，因此，该实验条件可用于预处理微晶纤维素。
3)配置4％NaOH/7％Urea溶液，向该溶液中加入15g/L微晶纤维素，-20℃下冰冻处理24h后，置于室温下融化，当溶液升温至-14℃时，溶液呈冰水混合物状态，此时进行搅拌，NaOH/Urea-纤维素溶液底部有片状纤维素沉淀析出，说明此时该溶液体系已达到最高纤维素溶解能力。
实施例6 NaOH与Urea浓度的筛选
本实施例对NaOH与Urea浓度的进行筛选，具体实验条件、操作及实验结果如下：
1)配置3％NaOH溶液，向溶液中分别添加浓度为7、8、10、12、14(％)Urea，在不同浓度的NaOH/Urea溶液体系中加入5g微晶纤维素，-20℃下冰冻处理后，室温下融化，当溶液升温至-14℃时，溶液呈冰水混合物状态，此时进行搅拌，微晶纤维素均不溶。
2)配置3.5％NaOH溶液，向溶液中分别添加7、8、10、12、14(％)Urea，在不同浓度的NaOH/Urea溶液体系中加入微晶纤维素，-20℃下冰冻处理后，室温下融化，当溶液升温至-14℃时，溶液呈冰水混合物状态，此时进行搅拌，微晶纤维素溶解量依次为10 g/L、10g/L、9g/L、9g/L、8g/L，结果如图3所示。
3)配置4％NaOH溶液，向溶液中分别添加7、8、10、12、14(％)Urea，在不同浓度的NaOH/Urea溶液体系中加入微晶纤维素，-20℃下冰冻处理后，室温下融化，当溶液升温至-14℃时，溶液呈冰水混合物状态，此时进行搅拌，微晶纤维素溶解量依次为14g/L、 14g/L、14g/L、13g/L、12g/L，结果如图3所示。
4)配置5％NaOH溶液，向溶液中分别添加7、8、10、12、14(％)Urea，在不同浓度的NaOH/Urea溶液体系中加入微晶纤维素，-20℃下冰冻处理后，室温下融化，当溶液升温至-14℃时，溶液呈冰水混合物状态，此时进行搅拌，微晶纤维素溶解量依次为18g/L、 18g/L、16g/L、15g/L、15g/L，结果如图3所示。
5)配置7％NaOH溶液，向溶液中分别添加7、8、10、12、14(％)Urea，在不同浓度的NaOH/Urea溶液体系中加入微晶纤维素，-20℃下冰冻处理后，室温下融化，当溶液升温至-14℃时，溶液呈冰水混合物状态，此时进行搅拌，微晶纤维素溶解量依次为12g/L、 12g/L、10g/L、10g/L、9g/L，结果如图3所示。
6)以微晶纤维素溶解量为响应值构建纤维素测试值与预测值响应分析表，如表6所示，分别绘制二维等高线图、三维响应曲面图(如图4、图5所示)，对各配比纤维素溶液响应情况分析最优配比为4％NaOH/7％Urea(如表7所示)，微晶纤维素的最大溶解量为14g/L。
表6：
表7：
实施例7 NaOH/Urea溶液体系预处理纤维素体系PH筛选
本实施例在实施例6的基础上继续试验，通过观察不同PH值对NaOH/Urea溶液体系预处理纤维素的通过NaOH/Urea溶液体系处理微晶纤维素，观察纤维素在该溶液体系下因不同实验操作产生的变化，具体实验条件、操作及实验结果如下：
1)配置5％NaOH/10％Urea溶液，向该溶液中加入14g/L微晶纤维素，-20℃下冰冻处理24h后，置于室温下融化，当溶液升温至-14℃时，溶液呈冰水混合物状态，此时进行搅拌，溶液逐渐澄清(pH>14)，取1mL作为备用样本。加HCl回调pH至10，溶液浑浊，取1mL作为备用样本。通过纱布过滤，取滤液1mL作为备用样本。
2)将三种备用样本各取1μL涂抹于载玻片上，将载玻片用液体导电胶固定在饼状电池上喷金，喷金后放于扫描电镜载物台采集图像。图6为未加HCl的NaOH/Urea-纤维素溶液 (pH>14)，纤维素含量多，纤维素呈长条状；图7NaOH/Urea-纤维素溶液加HCl回调后析出的滤渣，可能为析出的絮状纤维素，纤维素与氯离子结合，使得分子间、分子内氢键断裂，使得纤维素片层化；图8为NaOH/Urea-纤维素溶液加HCl回调后滤液，纤维素含量比图6少，形状与图6相似，说明再加HCl回调的过程中，虽有纤维素析出，但在滤液中依旧含有部分纤维素。
实施例8 NaOH/Urea溶液体系预处理纤维素获得新型培养基
本实施例是对NaOH/Urea-纤维素培养基进行功能验证，测定新型培养基对多株不同种属菌株的培养能力。
实验一：
1)配置4％NaOH/7％Urea溶液，向该溶液中加入14g/L微晶纤维素，-20℃下冰冻处理24h后，置于室温下融化，当溶液升温至-14℃时，溶液呈冰水混合物状态，此时进行搅拌，溶液逐渐澄清，使用HCl回调pH至10后，利用纱布进行过滤，收集滤液。
2)在滤液中按比例添加NH4Cl(2g/L)、MgSO4(0.2g/L)、NaCl(10g/L)，115℃高压蒸汽灭菌15min。接种盐单胞菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、乳酪短杆菌、地衣芽孢杆菌 (OD600＝0.5～0.6)，37℃、150rpm下摇床培养，菌株均可生长，72h后将培养物转移至50mL 离心管中，在12000rpm下离心10min，弃上清，将沉淀物置于-70℃预冻4h后，置于-60℃真空冷冻干燥机中冻干过夜。使用万分之一天平称取干重，CDW(细胞干重)分别为 0.381g/L、0.403g/L、0.522g/L、0.343g/L、0.362g/L。则盐单胞菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、乳酪短杆菌、地衣芽孢杆菌可在该培养基中进行正常增殖，说明了该种方法处理下得到的培养基具备一定的微生物培养能力。
实验二：
1)配置4％NaOH/7％Urea溶液，向该溶液中加入14g/L微晶纤维素，-20℃下冰冻处理24h后，置于室温下融化，当溶液升温至-14℃时，溶液呈冰水混合物状态，此时进行搅拌，溶液逐渐澄清，使用HCl回调pH至10后，利用纱布进行过滤，收集滤液。
2)在滤液中按比例添加NH4Cl(2g/L)、MgSO4(0.2g/L)、NaCl(10g/L)，115℃高压蒸汽灭菌15min。以3％的接种量往其中接种藤黄微球菌(OD600＝0.5～0.6)。37℃、150rpm下摇床培养。72h后取1mL菌液放置于1.5mL EP管中，4000rpm离心5min，取下层沉淀1μL 涂抹于载玻片上，将载玻片用液体导电胶固定在饼状电池上喷金，喷金后放于电镜载物台采集图像，如图9示。
实验三：
1)配置4％NaOH/7％Urea溶液，向该溶液中加入14g/L微晶纤维素，-20℃下冰冻处理24h后，置于室温下融化，当溶液升温至-14℃时，溶液呈冰水混合物状态，此时进行搅拌，溶液逐渐澄清，使用HCl回调pH至10后，利用纱布进行过滤，收集滤液。
(2)在滤液中按比例添加NH4Cl(2g/L)、MgSO4(0.2g/L)、NaCl(10g/L)，115℃高压蒸汽灭菌15min。以3％的接种量往其中接种藤黄微球菌(OD600＝0.5～0.6)。37℃、150rpm下摇床发酵培养72h。每隔8h对发酵过程中的pH值、CDW以及对发酵体系中纤维素含量(斐林试剂法间接测定)进行测定，发现随培养时间增加，pH值、葡萄糖含量处于逐渐降低的趋势，CDW则处于持续增长的趋势，CDW平均约为0.52g/L，如图10所示。
实验四：
1)配置4％NaOH/7％Urea溶液，向该溶液中加入14g/L微晶纤维素，-20℃下冰冻处理24h后，置于室温下融化，当溶液升温至-14℃时，溶液呈冰水混合物状态，此时进行搅拌，溶液逐渐澄清，使用HCl回调pH至10后，利用纱布进行过滤，收集滤液。
2)在滤液中按比例添加NH4Cl(2g/L)、MgSO4(0.2g/L)、NaCl(10g/L)，115℃高压蒸汽灭菌15min。以3％的接种量往其中接种藤黄微球菌(OD600＝0.5～0.6)。37℃、150rpm下摇床发酵培养72h。72h后将培养物转移至50mL离心管中，在12000rpm下离心10min，弃上清，将沉淀物置于-70℃预冻4h后，置于-60℃真空冷冻干燥机中冻干过夜。
3)酯化液配制：取500mL无水甲醇(AR)，加入约1g/L苯甲酸和3％(v/v)浓硫酸 (质量分数98％，小心缓慢加入至甲醇中)。
4)取20mg左右冻干的细胞样品，精确(0.0001g)称重后放于酯化管中，分别加入2mL氯仿(AR)和2mL酯化液。称取10mg左右标准PHA(聚羟基脂肪酸)样品(PHB)，用同样方式处理，制成标准样品的氯仿溶液。密封酯化管，震荡混合均匀后，100℃恒温酯化4h。冷却至室温后，加入1mL ddH2O，震荡至完全混匀后，静置约30min分层。待水相和有机相完全分离后，取下层(氯仿相)溶液进行GC分析，结果如图11所示。图11-A 为氯仿样品色谱结果，第一个色谱峰为氯仿溶液，保留时间2.658min，图11-B为PHA标准样品酯化后色谱结果，第一个色谱峰为3HB，保留时间为2.284min,第二个色谱峰为氯仿，保留时间为2.681min；图11-C为藤黄微球菌冻干菌体酯化后色谱结果，其中第一个峰保留时间为2.287min与标准品3HB保留时间基本一致，经测算3HB含量为28.19wt％。说明藤黄微球菌可在该种方法处理下得到的培养基中进行增殖同时积累PHA。
实验五：
1)利用中药粉碎机粉碎甘草秸秆，过30目筛，得甘草秸秆粉末。配置4％NaOH/7％Urea溶液，向该溶液中加入10g/L甘草秸秆粉末，-20℃下冰冻处理24h后，置于室温下融化，当溶液升温至-14℃时，溶液呈冰水混合物状态，此时进行搅拌，溶液有部分沉淀。使用HCl回调pH至10后，利用纱布进行过滤，收集滤液。
2)在滤液中按比例添加NH4Cl(2g/L)、MgSO4(0.2g/L)、NaCl(10g/L)，115℃，高压蒸汽灭菌15min，以3％的接种量往其中接种藤黄微球菌(OD600＝0.5～0.6)，发现0h OD600＝0.31 在48h后OD600增长至OD600＝0.75，证明藤黄微球菌可在该培养基中进行增殖，说明了该种方法处理下得到的培养基具备一定的微生物培养能力。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
