多粘芽孢杆菌高产胞外多糖培养基及其应用方法
技术领域
本发明属于微生物
技术领域
，特别涉及多粘芽孢杆菌高产胞外多糖培养基及其应用方法。背景技术
微生物胞外多糖是微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类糖类化合物，有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的则进入培养基形成黏液，称为黏液多糖，是微生物适应环境的产物。微生物胞外多糖的结构比植物多糖的结构更为复杂，具有独特的理化性质和生物活性，因此，在各行各业中得到了广泛的应用。但是随着社会发展，对微生物胞外多糖需求在不断的增加，而当前生产胞外多糖技术及产量并不能满足人们对微生物胞外多糖的需求，因此提高微生物发酵生产胞外多糖产量有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多粘芽孢杆菌高产胞外多糖培养基及应用方法，通过该培养基应用于多粘芽孢杆菌发酵生产胞外多糖，能够有效提高胞外多糖产量，胞外多糖生产周期短，生产效率高。
为实现上述目的，本发明提供了一种多粘芽孢杆菌高产胞外多糖的培养基，所述培养基包括种子培养基和发酵培养基，所述种子培养基，按质量浓度计包括：酵母粉20～40g/L，葡萄糖25～40g/L，蛋白胨10～15g/L，磷酸二氢钾0.1～8g/L，硝酸铵0.2～2g/L，氯化钠0.05～0.1g/L，七水硫酸镁5～15g/L，氯化铁0.05～0.1g/L；
所述发酵培养基，按质量浓度计包括：蔗糖50～80g/L，发酵调节物 0.5～0.6g/L，蛋白胨20～45g/L，酵母粉35～45g/L，磷酸二氢钾0.5～10g/L，七水硫酸镁5～15g/L，硝酸铵0.2～2g/L，氯化钠0.05～0.1g/L，硝酸铵0.2～2g/L，氯化铁0.05～0.1g/L；
所述发酵调节物由A和B两组分混合而成，其中组分A选自棕榈酰三肽-1 和棕榈酰三肽-7中的一种或是两种的混合物，组分B选自积雪草苷和羟基积雪草苷中的一种或是两种的混合物，组分A和B质量比为4:1～1:2。
进一步，上述技术方案中，所述培养基包括种子培养基和发酵培养基，所述种子培养基，按质量浓度计包括：酵母粉30g/L，葡萄糖25g/L，蛋白胨13g/L，磷酸二氢钾4g/L，硝酸铵1g/L，氯化钠0.08g/L，七水硫酸镁15g/L，氯化铁 0.07g/L；
所述发酵培养基，按质量浓度计包括：蔗糖60g/L，发酵调节物0.55g/L，蛋白胨35g/L，酵母粉40g/L，磷酸二氢钾4g/L，七水硫酸镁10g/L，硝酸铵1g/L，氯化钠0.08g/L，硝酸铵1g/L，氯化铁0.07g/L；
所述发酵调节物由A和B两种组分混合而成，其中组分为棕榈酰三肽-1，组分B为积雪草苷，组分A和B质量比为3:2。
本方明的一种多粘芽孢杆菌发酵制备胞外多糖的方法，包括以下步骤：
(1)按照种子培养基配方比例称取酵母粉，葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氢钾，硝酸铵，氯化钠，七水硫酸镁和氯化铁，加入水溶解，灭菌后制得到种子培养基，将多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中培养，得种子液；
所述种子培养基按质量浓度计组成为：酵母粉20～40g/L，葡萄糖25～40g/L，蛋白胨10～15g/L，磷酸二氢钾0.1～8g/L，硝酸铵0.2～2g/L，氯化钠0.05～0.1g/L，七水硫酸镁5～15g/L，氯化铁0.05～0.1g/L，其余为水；
(2)按发酵培养基配方比例称取蔗糖，发酵调节物，蛋白胨，酵母粉，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，硝酸铵，氯化钠，硝酸铵，氯化铁，加入水溶解后灭菌得到发酵培养基，将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵完成后，得胞外多糖发酵液；
所述发酵培养基按质量浓度计组成为：蔗糖50～80g/L，发酵调节物 0.50～0.60g/L，蛋白胨20～45g/L，酵母粉35～45g/L，磷酸二氢钾0.5～10g/L，七水硫酸镁5～15g/L，硝酸铵0.2～2g/L，氯化钠0.05～0.1g/L，硝酸铵0.2～2g/L，氯化铁0.05～0.1g/L，其余为水；
所述发酵调节物由A和B两种组分混合而成，其中组分A选自棕榈酰三肽-1和棕榈酰三肽-7中的一种或是两种的混合物，组分B选自积雪草苷和羟基积雪草苷中的一种或是两种的混合物，组分A和B质量比为4:1～1:2。
进一步，上述技术方案中，步骤(1)中所述灭菌温度为120℃～130℃。
进一步，上述技术方案中，步骤(1)中所述灭菌时间为15～30min。
进一步，上述技术方案中，步骤(1)中多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中接种量为6％～12％。
进一步，上述技术方案中，步骤(1)中多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中在温度30～37℃，转速200～240r/min，培养36h～38h。
进一步，上述技术方案中，步骤(2)中所述灭菌温度为120℃～130℃,时间为15～30min。
进一步，上述技术方案中，步骤(2)中所述种子液接入量为6％～12％。
进一步，上述技术方案中，步骤(2)中发酵培养条件包括：装料系数0.6，温度30～37℃，压力0.04～0.07MPa，通气量0.8～1.0v/v.min，发酵时间46～48h。
与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明提供一种多粘芽孢杆菌高产胞外多糖培养基，该培养基营养丰富，加入的七水硫酸镁和氯化铁能维持微生物正常代谢需求，并添加发酵调节物，该调节物由棕榈酰三肽-1和棕榈酰三肽-7中一种或两种与积雪草苷和羟基积雪草苷中一种或两种组成，通过调节多粘芽孢杆菌生理反应等过程，促进多粘芽孢杆菌繁殖及胞外多糖的分泌，从而有效的提高多粘芽孢杆菌发酵制备胞外多糖产量，采用本发明提供多粘芽孢杆菌高产胞外多糖培养基胞外多糖产量提升效果明显。
2.采用本发明培养基促进了多粘芽孢杆菌生理反应速率，缩短了发酵的周期，有利于提高多粘芽孢杆菌发酵生产胞外多糖效率，节约时间；其次，本发明多粘芽孢杆菌发酵生产胞外多糖方法简单容易操作、培养基制备成本低，发酵适应条件范围宽。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
培养基样品1：包括种子培养基和发酵培养基；
种子培养基(按质量浓度计)：酵母粉30g/L，葡萄糖25g/L，蛋白胨13g/L，磷酸二氢钾4g/L，硝酸铵1g/L，氯化钠0.08g/L，七水硫酸镁15g/L，氯化铁 0.07g/L，其余为水；
发酵培养基(按质量浓度计)：蔗糖60g/L，发酵调节物0.55g/L，蛋白胨35g/L，酵母粉40g/L，磷酸二氢钾4g/L，七水硫酸镁15g/L，硝酸铵1g/L，氯化钠0.08g/L，硝酸铵1g/L，氯化铁0.07g/L，其余为水；
所述发酵调节物由A和B两种组分混合而成，其中组分为棕榈酰三肽-1，组分B为积雪草苷，组分A和B质量比为3:2。
对比培养基1-1：与培养基样品1不同的是没有发酵调节物，其他与培养基样品1基本相同。
对比培养基1-2：与培养基样品1不同的是以等量的组分A作为发酵调节物，其他与培养基样品1基本相同。
对比培养基1-3：与培养基样品1不同的是以等量的组分B作为发酵调节物，其他与培养基样品1基本相同。
发酵制备胞外多糖步骤：
(1)按照种子培养基配方比例称取酵母粉，葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氢钾，硝酸铵，氯化钠，七水硫酸镁和氯化铁，加入水溶解，灭菌后制得到种子培养基，灭菌温度为120℃，灭菌时间为15min，将多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中(多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中接种量为6％)培养，多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中在温度30℃，转速200r/min，培养36h，得种子液；
(2)按发酵培养基配方比例称取蔗糖，发酵调节物(对比培养基1-1中发酵培养基不含发酵调节物)，蛋白胨，酵母粉，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，硝酸铵，氯化钠，硝酸铵，氯化铁，加入水溶解后灭菌(灭菌温度为120℃,时间为 15min)得到发酵培养基，将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中(种子液接入量为6％)进行发酵培养，其中装料系数为0.6，发酵温度为30℃，压力为0.05 MPa，通气量为0.9v/v.min，发酵46h得胞外多糖发酵液。
不同培养基发酵培养胞外多糖的产量
不同培养基发酵培育胞外多糖的产量如表1所示，其中采用培养基样品1 胞外多糖产量为80.61g/L，采用对比培养基1-1产量最低为13.62g/L，采用对比培养基1-2和对比培养基1-3产量分别为41.15g/L和23.92g/L，显而易见培养基样品1相对对比培养基用于多粘芽孢杆菌发酵生产胞外多糖，产量提高明显。
表1不同培养基发酵培养胞外多糖产量
培养基
胞外多糖产量(g/L)
培养基样品1
80.61
对比培养基1-1
13.62
对比培养基1-2
41.15
对比培养基1-3
23.92
实施例2
培养基样品2：包括种子培养基和发酵培养基；
种子培养基(按质量浓度计)：酵母粉20g/L，葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硝酸铵0.2g/L，氯化钠0.05g/L，七水硫酸镁5g/L，氯化铁 0.05g/L，其余为水；
发酵培养基(按质量浓度计)：蔗糖50g/L，发酵调节物0.5g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉35g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水硫酸镁5g/L，硝酸铵0.2g/L，氯化钠 0.05g/L，硝酸铵0.2g/L，氯化铁0.05g/L，其余为水；
发酵调节物由A和B两种组分混合而成，其中组分A为棕榈酰三肽-7，组分B选自积雪草苷，组分A和B质量比为4:1。
对比培养基2-1：与培养基样品2不同的是没有发酵调节物，其他与培养基样品2基本相同。
对比培养基2-2：与培养基样品2不同的是以等量的组分A作为发酵调节物，其他与培养基样品2基本相同。
对比培养基2-3：与培养基样品2不同的是以等量的组分B作为发酵调节物，其他与培养基样品2基本相同。
发酵制备胞外多糖步骤：
(1)按照种子培养基配方比例称取酵母粉，葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氢钾，硝酸铵，氯化钠，七水硫酸镁和氯化铁，加入水溶解，灭菌后制得到种子培养基，灭菌温度为125℃，灭菌时间为20min，将多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中(多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中接种量为10％)培养，多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中在温度35℃，转速220r/min，培养36h，得种子液；
(2)按发酵培养基配方比例称取蔗糖，发酵调节物(对比培养基2～1中发酵培养基不含发酵调节物)，蛋白胨，酵母粉，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，硝酸铵，氯化钠，硝酸铵，氯化铁，加入水溶解后灭菌(灭菌温度为125℃,时间为 20min)得到发酵培养基，将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中(种子液接入量为10％)进行发酵培养，其中装料系数为0.6，发酵温度为35℃，压力为 0.05MPa，通气量为0.8v/v.min，发酵48h得胞外多糖发酵液；
不同培养基发酵培养胞外多糖的产量
不同培养基发酵培育胞外多糖的产量如表2所示，其中采用培养基样品2 胞外多糖产量为76.45g/L，采用对比培养基2-1产量最低为13.43g/L，采用对比培养基2-2和对比培养基2-3产量分别为33.83g/L和23.71g/L，显而易见培养基样品2相对对比培养基用于多粘芽孢杆菌发酵生产胞外多糖，产量提高明显。
表2不同培养基发酵培养胞外多糖产量
实施例3
培养基样品3：包括种子培养基和发酵培养基；
种子培养基(按质量浓度计)：酵母粉40g/L，葡萄糖40g/L，蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾8g/L，硝酸铵2g/L，氯化钠0.1g/L，七水硫酸镁10g/L，氯化铁0.1g/L，其余为水；
发酵培养基(按质量浓度计)：蔗糖80g/L，发酵调节物0.6g/L，蛋白胨45g/L，酵母粉45g/L，磷酸二氢钾10g/L，七水硫酸镁10g/L，硝酸铵2g/L，氯化钠0.1g/L，硝酸铵2g/L，氯化铁0.1g/L，其余为水；
发酵调节物由A和B两种组分混合而成，其中组分A为棕榈酰三肽-1和棕榈酰三肽-7中的混合物，其中棕榈酰三肽-1和棕榈酰三肽-7质量比为1:1，组分 B为自积雪草苷，组分A和B质量比为1:2。
对比培养基3-1：与培养基样品3不同的是没有发酵调节物，其他与培养基样品3基本相同。
对比培养基3-2：与培养基样品3不同的是以等量的组分A作为发酵调节物，其他与培养基样品3基本相同。
对比培养基3-3：与培养基样品3不同的是以等量的组分B作为发酵调节物，其他与培养基样品3基本相同。
发酵制备胞外多糖步骤：
(1)按照种子培养基配方比例称取酵母粉，葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氢钾，硝酸铵，氯化钠，七水硫酸镁和氯化铁，加入水溶解，灭菌后制得到种子培养基，灭菌温度为130℃，灭菌时间为30min，将多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中(多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中接种量为12％)培养，多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中在温度37℃，转速240r/min，培养38h，得种子液；
(2)按发酵培养基配方比例称取蔗糖，发酵调节物(对比培养基3-1中发酵培养基不含发酵调节物)，蛋白胨，酵母粉，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，硝酸铵，氯化钠，硝酸铵，氯化铁，加入水溶解后灭菌(灭菌温度为130℃,时间为 30min)得到发酵培养基，将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中(种子液接入量为12％)进行发酵培养，其中装料系数为0.6，发酵温度为37℃，压力为 0.07MPa，通气量为1.0v/v.min，发酵48h得胞外多糖发酵液；
不同培养基发酵培养胞外多糖的产量
不同培养基发酵培育胞外多糖的产量如表3所示，其中采用培养基样品3 胞外多糖产量为77.19g/L，采用对比培养基3-1产量最低为13.70g/L，采用对比培养基3-2和对比培养基3-3产量分别为36.92g/L和23.97g/L，显而易见培养基样品3相对对比培养基用于多粘芽孢杆菌发酵生产胞外多糖，产量提高明显。
表3不同培养基发酵培养胞外多糖产量
培养基
胞外多糖产量(g/L)
培养基样品3
77.19
对比培养基3-1
13.70
对比培养基3-2
36.92
对比培养基3-3
23.97
实施例4
培养基样品4：包括种子培养基和发酵培养基；
种子培养基(按质量浓度计)：酵母粉35g/L，葡萄糖30g/L，蛋白胨14g/L，磷酸二氢钾7g/L，硝酸铵1.5g/L，氯化钠0.09g/L，七水硫酸镁13g/L，氯化铁 0.08g/L，其余为水；
发酵培养基(按质量浓度计)：蔗糖70g/L，发酵调节物0.58g/L，蛋白胨40g/L，酵母粉40g/L，磷酸二氢钾8g/L，七水硫酸镁13g/L，硝酸铵1.5g/L，氯化钠 0.09g/L，硝酸铵1.5g/L，氯化铁0.08g/L，其余为水；
发酵调节物由A和B两种组分混合而成，其中组分A为棕榈酰三肽-1，组分B为羟基积雪草苷，组分A和B质量比为3:2。
对比培养基4-1：与培养基样品4不同的是没有发酵调节物，其他与培养基样品4基本相同。
对比培养基4-2：与培养基样品4不同的是以等量的组分A作为发酵调节物，其他与培养基样品4基本相同。
对比培养基4-3：与培养基样品4不同的是以等量的组分B作为发酵调节物，其他与培养基样品4基本相同。
发酵制备胞外多糖步骤：
(1)按照种子培养基配方比例称取酵母粉，葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氢钾，硝酸铵，氯化钠，七水硫酸镁和氯化铁，加入水溶解，灭菌后制得到种子培养基，灭菌温度为125℃，灭菌时间为20min，将多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中(多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中接种量为8％)培养，多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中在温度35℃，转速220r/min，培养36h，得种子液；
(2)按发酵培养基配方比例称取蔗糖，发酵调节物(对比培养基4～1中发酵培养基不含发酵调节物)，蛋白胨，酵母粉，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，硝酸铵，氯化钠，硝酸铵，氯化铁，加入水溶解后灭菌(灭菌温度为125℃,时间为 20min)得到发酵培养基，将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中(种子液接入量为8％)进行发酵培养，其中装料系数为0.6，发酵温度为37℃，压力为0.05 MPa，通气量为0.9v/v.min，发酵48h得胞外多糖发酵液；
不同培养基发酵培养胞外多糖的产量
不同培养基发酵培育胞外多糖的产量如表4所示，其中采用培养基样品4 胞外多糖产量为69.28g/L，采用对比培养基4-1产量最低为13.54g/L，采用对比培养基4-2和对比培养基4-3产量分别为43.82g/L和20.76g/L，显而易见培养基样品4相对对比培养基用于多粘芽孢杆菌发酵生产胞外多糖，产量提高明显。
表4不同培养基发酵培养胞外多糖产量
培养基
胞外多糖产量(g/L)
培养基样品4
69.28
对比培养基4-1
13.54
对比培养基4-2
43.82
对比培养基4-3
20.76
实施例5
培养基样品5：包括种子培养基和发酵培养基；
种子培养基(按质量浓度计)：酵母粉25g/L，葡萄糖35g/L，蛋白胨11g/L，磷酸二氢钾3g/L，硝酸铵1g/L，氯化钠0.07g/L，七水硫酸镁8g/L，氯化铁0.08g/L，其余为水；
发酵培养基(按质量浓度计)：蔗糖60g/L，发酵调节物0.52g/L，蛋白胨30g/L，酵母粉35g/L，磷酸二氢钾4g/L，七水硫酸镁6g/L，硝酸铵1.5g/L，氯化钠0.06g/L，硝酸铵0.8g/L，氯化铁0.07g/L，其余为水；
发酵调节物由A和B两种组分混合而成，其中组分A为棕榈酰三肽-1，组分B为积雪草苷和羟基积雪草苷的混合物，积雪草苷和羟基积雪草苷质量比为 1:1，组分A和B质量比为4:3。
对比培养基5-1：与培养基样品5不同的是没有发酵调节物，其他与培养基样品5基本相同。
对比培养基5-2：与培养基样品5不同的是以等量的组分A作为发酵调节物，其他与培养基样品5基本相同。
对比培养基5-3：与培养基样品5不同的是以等量的组分B作为发酵调节物，其他与培养基样品5基本相同。
发酵制备胞外多糖步骤：
(1)按照种子培养基配方比例称取酵母粉，葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氢钾，硝酸铵，氯化钠，七水硫酸镁和氯化铁，加入水溶解，灭菌后制得到种子培养基，灭菌温度为130℃，灭菌时间为15min，将多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中(多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中接种量为10％)培养，多粘芽孢杆菌接种到种子培养基中在温度37℃，转速200r/min，培养36h，得种子液；
(2)按发酵培养基配方比例称取蔗糖，发酵调节物(对比培养基5-1中发酵培养基不含发酵调节物)，蛋白胨，酵母粉，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，硝酸铵，氯化钠，硝酸铵，氯化铁，加入水溶解后灭菌(灭菌温度为130℃,时间为 15min)得到发酵培养基，将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中(种子液接入量为10％)进行发酵培养，其中装料系数为0.6，发酵温度为37℃，压力为 0.07MPa，通气量为0.8v/v.min，发酵48h得胞外多糖发酵液；
不同培养基发酵培养胞外多糖的产量
不同培养基发酵培育胞外多糖的产量如表5所示，其中采用培养基样品3 胞外多糖产量为72.37g/L，采用对比培养基5-1产量最低为13.42g/L，采用对比培养基5-2和对比培养基5-3产量分别为43.95g/L和21.84g/L，显而易见培养基样品5相对对比培养基用于多粘芽孢杆菌发酵生产胞外多糖，产量提高明显。
表5不同培养基发酵培养胞外多糖产量
培养基
胞外多糖产量(g/L)
培养基样品5
72.37
对比培养基5-1
13.42
对比培养基5-2
43.95
对比培养基5-3
21.84
综上所述，本发明的培养基营养丰富，培养多粘芽杆菌效果好，应用于多粘芽孢杆菌发酵制备胞外多糖产量高，特别以棕榈酰三肽-1和积雪草苷质量比为3:2作为发酵调节物，粘芽孢杆菌发酵制备胞外多糖产量突出。同时本发明多粘芽孢杆菌发酵生产胞外多糖生产周期短，生产效率高，发酵适用条件范围广，生产稳定。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
