本发明公开了一种生物法生产L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)的方法,是在大肠杆菌中敲除了分解代谢途径中的甲硫氨酸合成酶基因(metH),并引入了一条新的产L-5-MTHF的代谢途径构建了产L-5-MTHF的工程菌BL21-WL菌株或BL21(ΔmetH)-C1T菌株,通过对所构建的工程菌产L-5-MTHF的发酵条件优化,所述工程菌最大细胞干重产量可达445.94μg·g~(-1),比优化前提高了99.71%,达到出发菌株的10.0倍,换算为每升培养物的产量后可达1249.11μg,远大于目前报道中的以E.coli为宿主菌的L-5-MTHF产量(119.84μg·L~(-1))。预示本发明方法及构建的工程菌具有极大的应用价值和市场前景。