一种共培养促进红曲菌生产黄色素的方法
技术领域
本发明涉及一种共培养促进红曲菌生产黄色素的方法，属于微生物发酵
技术领域
。背景技术
目前市场上的色素主要可分为天然色素与非天然色素，其中非天然色素又主要包括合成色素与半合成色素。市场上的合成与半合成色素约占市场份额的70％，而天然色素只占约30％。由于非天然色素有潜在的致毒性以及一些其他的不确定性，市场上的非天然色素的需求量逐渐减少。并且随着人们生活水平的不断提高，人们对无毒无害的天然色素的需求越来越高。红曲色素作为一种天然着色剂，除了广泛的应用于食品行业外，在制药、纺织和化妆品工业也有着巨大的市场前景。红曲红色素已经实现工业化生产，而红曲黄色素则由于色价较低还没有实现工业化生产。
近年来，红曲黄色素的研究越来越受到关注，国内外研究者通过发酵优化的方式不同程度上提高了红曲黄色素的产量。李瑞杰等人使用红色红曲菌M-7为实验菌株，将发酵培养基的pH控制到3-4，以2％的蔗糖为最佳碳源，以0.2％的硫酸铵作为最佳氮源，使得水溶性黄色素色价达到5.56U/mL。Zhou等人通过响应面方法快速筛选重要的影响因素，并开发了多项式模型来优化培养基，以从M.anka突变株MYM为试验菌株生产黄色素，在该多项式模型下，在摇瓶中红曲黄色素的产量可以达到88.14U/mL，在5升发酵罐中可以达到92.45U/mL。Zhong等人在非离子表面活性剂胶束水溶液中萃取发酵后，由发酵液制备红曲黄色素。首先，通过基于离子液体的微乳液萃取，将红曲色素从非离子型表面活性剂胶束水溶液转移到离子液相中，其中基于410nm的吸光度，黄色红曲色素的回收率达到95.5％。然后，通过离子液体-丁醇两相萃取法回收了离子液相中的黄色红曲色素，回收率达到了95％。
据报道，共培养体系相比于纯培养，可以提供更加复杂的生长环境，进而对微生物的生长、代谢产生影响。经多项研究表明，通过构建一种共培养发酵系统，可以使某些目的产物的产量得到显著提升。比如Monascus purpureus MTCC 369和Monascus ruber MTCC1880共培养可以提高Lovastatin的产量，Saccharomyces cerevisiae和Pichia stipitis共培养可以提高生物乙醇的产量，Bacillus subtilisin和Lactobacillus paracaseiHD1-7共培养可以提高Paracin1.7的产量。
目前还没有通过共培养促进红曲菌产红曲黄色素的研究，而采用普通的液态发酵培养基成分，很难达到高产红曲黄色素的目的。本发明通过在发酵培养基中加入微生物发酵液，即可大幅度促进红曲菌黄色素的合成，具有重要的研究和应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种促进红曲菌发酵生产红曲黄色素的方法，所述方法是在红曲菌的发酵初始或者发酵过程中加入微生物的发酵液或发酵上清液；所述微生物为枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、酿酒酵母或黑曲霉中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述发酵是在液态环境下发酵的。
在一种实施方式中，所述发酵上清液是去除了微生物细胞的发酵液。
在一种实施方式中，所述发酵液的活菌数达到1×106～1×108CFU/mL。
在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌ACCC 04178，所述乳酸杆菌包括乳酸杆菌ACCC 19955，所述酿酒酵母包括酿酒酵母ACCC 20039。
在一种实施方式中，所述红曲菌是能够产红曲黄色素的红曲菌。
在一种实施方式中，所述红曲菌包括但不限于紫色红曲菌(Monascus purpureus)ZH106-E、紫色红曲菌(Monascus purpureus)CICC 40225、紫色红曲菌(Monascuspurpureus)CICC 40937、红色红曲菌(Monascus ruber)CGMCC 3.465或红色红曲菌(Monascus ruber)CGMCC 3.4649。
在一种实施方式中，所述微生物发酵液的添加量为红曲菌发酵体系总体积的1％-10％。
在一种实施方式中，所述微生物发酵液的添加时机为红曲菌接种后0～96h内。
在一种实施方式中，所述发酵是在转速为150-250r/min，温度25-35℃条件下，发酵培养至少4d。
在一种实施方式中，所述发酵是在转速为180，温度30℃条件下，发酵培养8d。
在一种实施方式中，所述发酵的培养基含有玉米淀粉40-80g/L，硫酸铵3-8g/L，硝酸钠2-6g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾1.5-3.5g/L，磷酸氢二钾1.5-3.5g/L，氯化钙0.1-0.5g/L。
本发明还要求保护所述方法在制备红曲黄色素及含有红曲黄色素的食品添加剂中的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过添加微生物发酵液，增大红曲菌红曲色素的合成。该方法操作简单，且不会改变色素的结构，仅通过较低的附加投入，就可以提高红曲黄色素的合成，使红曲黄色素的色价达535U/mL，具有重大的经济效益。
具体实施方式
1、色价为色素浓度的一种表示方法，大小等于稀释倍数与稀释后的色素溶液在其吸收峰处对应的OD值的乘积，单位为U/mL。
取一定量的红曲菌发酵液使用无水乙醇稀释至合适范围(为了使最终的吸光度在0.2-0.8的范围内)，混匀，静置一段时间使色素完全溶于乙醇，取溶有色素的乙醇在410nm下检测吸光度值。
计算公式：黄色素色价＝OD410×稀释倍数
2、菌株
枯草芽孢杆菌：ACCC 04178。
乳酸杆菌：ACCC 19955。
酿酒酵母：ACCC 20039。
实施例1：不同菌株发酵生产色素
种子液培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。
发酵培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1，甘油酯400mL。
(1)种子液的制备
选紫色红曲菌ZH106-E(公开于名称为《Ethanol addition elevates cellrespiratory activity and causes overproduction of natural yellow pigments insubmerged fermentation of Monascus purpureus》的论文中)、紫色红曲菌CICC 40225、紫色红曲菌CICC 40937、红色红曲菌CGMCC3.465、红色红曲菌CGMCC 3.4649为摇瓶菌种，活化后分别接种到种子液培养基，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d，使菌浓达到1×107CFU/mL。
(2)发酵培养
将步骤(1)制备的处于对数生长期的红曲菌种子液以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养7d。结束后测得这八株菌ZH106-E、CICC 40225、CICC 40937、CGMCC 3.465、CGMCC 3.4649的红曲黄色素的色价分别为320U/mL、20U/mL、33U/mL、57U/mL、30U/mL。
表1 不同红曲菌株对液态发酵产黄色素的影响
实施例2：添加不同微生物发酵液(有菌)发酵生产色素
种子液培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。
发酵培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1，甘油酯400mL。
(1)种子液的制备
选择紫色红曲菌ZH106-E为摇瓶菌种活化后接种到种子液培养基，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d，获得红曲菌液体种子。
(2)微生物发酵液的制备
枯草芽孢杆菌：在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d。
乳酸杆菌：在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d。
酿酒酵母：在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d。
(3)发酵培养
取步骤(1)中处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养7d，在红曲菌摇瓶发酵第1天时分别加入培养体系体积4％的步骤(2)中不同微生物发酵液(有菌)。结束后测得的红曲黄色素的色价分别为267U/mL、375U/mL、300U/mL、296U/mL、230U/mL。
表2 不同微生物添加对红曲菌ZH106-E产黄色素的影响
实施例3：添加不同浓度枯草芽孢杆菌发酵液(有枯草芽孢杆菌)发酵生产色素
种子液培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。
发酵培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1，甘油酯400mL。
(1)种子液的制备
选择紫色红曲菌ZH106-E为摇瓶菌种活化后接种到种子液培养基，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d，获得红曲菌液体种子。
(2)枯草发酵液(有菌)的制备
同实施例2。
(3)发酵培养
取步骤(1)中处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养7d，在红曲菌摇瓶发酵第1天时将步骤(2)中枯草发酵液(有菌)以培养体系体积0％(即不添加)、2％、4％、6％、8％、10％(v/v)的添加量分别加入发酵培养基中。摇瓶发酵培养7d结束后测得的红曲黄色素的色价分别为260U/mL、371U/mL、381U/mL、186U/mL、214U/mL、204U/mL。
表3 枯草发酵液(有菌)不同添加量对红曲菌ZH106-E产黄色素的影响
实施例4：添加不同浓度枯草芽孢杆菌发酵液(无枯草芽孢杆菌)发酵生产色素
种子液培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。
发酵培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1，甘油酯400mL。
(1)种子液的制备
选择紫色红曲菌ZH106-E为摇瓶菌种活化后接种到种子液培养基，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d，获得红曲菌液体种子。
(2)枯草发酵液(无菌)的制备
枯草芽孢杆菌的发酵同实施例2，获得枯草发酵液(有菌)离心去除菌体获得枯草发酵液(无菌)。
(3)发酵培养
取步骤(1)中处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养7d，在红曲菌摇瓶发酵第1天时将步骤(2)中枯草发酵液(无菌)以培养体系体积0％(即不添加)、2％、4％、6％、8％、10％的添加量分别加入发酵培养基中。摇瓶发酵培养7d结束后测得的红曲黄色素的色价分别为282U/mL、374U/mL、485U/mL、515U/mL、503U/mL、494U/mL。
表4 枯草发酵液(无菌)不同添加量对红曲菌ZH106-E产黄色素的影响
实施例5：不同时间添加6％枯草发酵液(无菌)发酵生产色素
种子液培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。
发酵培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1，甘油酯400mL。
(1)种子液的制备
选择紫色红曲菌ZH106-E为摇瓶菌种活化后接种到种子液培养基，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d，获得红曲菌液体种子。
(2)枯草发酵液(无菌)的制备
同实施例4。
(3)发酵培养
取步骤(1)中处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养7d，分别在红曲菌摇瓶发酵第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天时加入培养体系体积6％(v/v)的步骤(2)中枯草发酵液(无菌)。摇瓶发酵培养7d结束后测得的红曲黄色素的色价分别为525U/mL、495U/mL、467U/mL、381U/mL、282U/mL、267U/mL、243U/mL。
表5 不同时间添加6％(v/v)枯草发酵液(无菌)对ZH106-E产黄色素的影响
实施例6：无添加枯草发酵液时，发酵不同时间红曲黄色素的产量
种子液培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。
发酵培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1，甘油酯400mL。
(1)种子液的制备
选择紫色红曲菌ZH106-E为摇瓶菌种活化后接种到种子液培养基，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d，获得红曲菌液体种子。
(2)发酵培养
取步骤(1)中处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，分别测定摇瓶发酵第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天时的色价。测得的红曲黄色素的色价分别为2U/mL、6U/mL、52U/mL、101U/mL、153U/mL、210U/mL、225U/mL、235U/mL。
表6 不添加枯草发酵液发酵不同时间的结果
实施例7：添加枯草发酵液(无菌)时，发酵不同时间红曲黄色素的产量
种子液培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。
发酵培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1，甘油酯400mL。
(1)种子液的制备
选择紫色红曲菌ZH106-E为摇瓶菌种活化后接种到种子液培养基，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d，获得红曲菌液体种子。
(2)枯草发酵液(无菌)的制备
同实施例4。
(3)发酵培养
取步骤(1)中处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，在摇瓶发酵第0天添加培养体系体积6％的步骤(2)中枯草发酵液(无菌)，之后每24h测定色价。结果显示，测得的红曲黄色素在摇瓶发酵的第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天时的色价分别为2U/mL、6U/mL、100U/mL、210U/mL、301U/mL、352U/mL、431U/mL、535U/mL。
表7 添加枯草发酵液发酵不同时间的结果
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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