一种利用荧光染色技术快速鉴定水稻镉敏感性的方法
技术领域
本发明涉及水稻育种
技术领域
，具体为一种利用荧光染色技术快速鉴定水稻镉敏感性的方法。背景技术
镉是全球分布最广、生物毒性最大的有害重金属，但水稻自身的耐镉能力较强，即使种植在土壤Cd含量低于0.3mg·kg-1的清洁土壤中，也有可能生产出镉超标的稻米。因此，国家投入大量的资金支持低镉积累水稻基因型的选育工作，稻米的镉含量与水稻的耐镉能力高度正相关，耐镉基因型在营养器官和籽粒中能够富集大量的镉，而对镉敏感的水稻基因型一般具有低镉积累特征。
目前对水稻基因型耐镉能力的鉴定，主要通过比较镉胁迫环境中，水稻幼苗的存活率、生长量、稻米中的镉含量等指标在基因型间的差异来完成，但是水稻生长期长，生长期间降雨量和光热资源变化大，致使试验结果的准确性差、误差大、效率低。
发明内容
(1)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用荧光染色技术快速鉴定水稻镉敏感性的方法，解决了现有方法检测水稻镉敏感性准确性较差、误差大且效率低的问题。
(2)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种利用荧光染色技术快速鉴定水稻镉敏感性的方法，包括以下步骤：
S1.胁迫处理
裁剪不同水稻基因型的离体叶片分别放入不同的试管内，并向试管内滴加等量的镉溶液直至没过离体叶片，对离体叶片浸泡6～48h，离体叶片在镉溶液中进行胁迫处理，叶肉细胞释放大量的活性氧(ROS)，在酶的催化下，活性氧与荧光素反应形成具有荧光的化合物；
S2.显微镜观察
将试管内的离体叶片取出并依次放在荧光显微镜下观察离体叶片中的荧光强度和分布特征，就能区分水稻叶肉细胞的镉敏感性在基因型间的差异，叶片中的荧光斑点越多、荧光面积越大，表明叶肉细胞释放的ROS越多、对镉离子的敏感性越强，耐镉性越差；反之，叶肉细胞的耐镉能力越强。
优选的，所述鉴定水稻镉敏感性的方法，还有另外一种方式，包括以下步骤：
S1.胁迫处理
裁剪不同水稻基因型的离体叶片分别放入不同的试管内，并向试管内滴加等量的镉溶液直至没过离体叶片，离体叶片在镉溶液中进行胁迫处理，叶肉细胞的过氧化氢分布特征在基因型间表现出明显的差异，把离体叶片放在不同浓度的镉溶液中处理12～48h，然后取出浸泡在含有还原型二氯荧光素 (DCF)的反应罐中孵育1～10h，DCF中无荧光的乙酸酯基团被叶片中的过氧化氢氧化，生成带电荷的二氯荧光素后对离体叶片进行染色处理；
S2.显微镜观察
将反应罐内的离体叶片放在荧光显微镜下观察离体叶片中的荧光强度和分布特征，就能快速准确地判断基因型的耐镉能力，叶片中绿色荧光斑点越多，说明镉胁迫环境叶片产生的过氧化氢越多、叶肉细胞对镉离子的敏感性越强，耐镉性越差；反之，叶片中绿色荧光斑点越少，叶肉细胞的耐镉能力越强。
优选的，所述鉴定水稻镉敏感性的方法，还有另外一种方式，包括以下步骤：
S1.胁迫处理
裁剪不同水稻基因型的离体叶片分别放入不同的试管内，并向试管内滴加等量的镉溶液直至没过离体叶片，离体叶片在镉溶液中进行胁迫处理，叶肉细胞的O2·-分布特征在基因型间表现出明显的差异，把离体叶片放在不同浓度的镉溶液中处理6～48h，然后取出浸泡在含有氮蓝四唑(NBT)的反应罐中孵育1～10h，氮蓝四唑被还原为蓝色的甲腙，在560nm处有最大吸收峰，然后对离体叶片进行染色处理；
S2.显微镜观察
将反应罐内的离体叶片放在荧光显微镜下观察离体叶片中的光斑大小和分布特征，就能快速准确地判断基因型的耐镉能力，叶片中蓝色斑点越多，说明镉胁迫环境叶片产生的O2·-越多、叶肉细胞对镉离子的敏感性越强，耐镉性越差；反之，叶片中蓝色荧光斑点越少，叶肉细胞的耐镉能力越强。
优选的，所述不同水稻基因型的离体叶片的裁剪长度为3cm。
优选的，所述镉溶液为氯化镉溶液，其中镉浓度为 0.9，4.5，9.0，13.5，18.0μmol·L-1中的一种或多种。
优选的，所述染色处理的详细操作为选择活性氧ROS分析试剂盒二氯二氢荧光素二乙酸酯，对离体叶片进行染色处理，孵育时间1～10h。
优选的，所述染色处理的详细操作为选择氮蓝四唑(NBT)染色试剂盒，对离体叶片进行染色处理，孵育时间1～10h。
(3)有益效果
本发明提供了一种利用荧光染色技术快速鉴定水稻镉敏感性的方法。具备以下有益效果：
本发明通过通过利用镉胁迫环境中离体叶片活性氧产生的数量与荧光强度的相关性，直观、准确地判断不同基因型水稻的镉敏感性，所需材料少，检测时间短，工作效率高，具有非常广阔的应用前景，对其他植物耐镉潜力的快速鉴定具有重要参考价值，该技术体系以水稻叶片中的荧光强度和分布特征为依据，鉴别不同基因型的镉敏感性，只需要少量的水稻叶片，且不受水稻大小的限制，能在较短的时间内，快速准确地鉴定出水稻的耐镉能力，具有效率高、重复性好、费用低廉等优点；并且根据叶片荧光强度鉴定技术筛选大量对耐镉敏感的基因型，可以有效地压缩田间试验的规模，节约时间和人力，大幅度提高低镉基因型水稻的筛选效率，加快低镉水稻新品种选育的步伐，值得大力推广。
附图说明
图1为本发明的镉胁迫对叶片中过氧化氢数量及分布特征的影响示意图；
图2为本发明的镉胁迫对叶片中O2·-数量及分布特征的影响示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
如图1-2所示，本发明实施例提供一种利用荧光染色技术快速鉴定水稻镉敏感性的方法，包括以下步骤：
S1.胁迫处理
裁剪不同水稻基因型的离体叶片分别放入不同的试管内，并向试管内滴加等量的镉溶液直至没过离体叶片，对离体叶片浸泡48h，离体叶片在镉溶液中进行胁迫处理，叶肉细胞释放大量的活性氧(ROS)，在酶的催化下，
活性氧与荧光素反应形成具有荧光的化合物；
S2.显微镜观察
将试管内的离体叶片取出并依次放在荧光显微镜下观察离体叶片中的荧光强度和分布特征，就能区分水稻叶肉细胞的镉敏感性在基因型间的差异，叶片中的荧光斑点越多、荧光面积越大，表明叶肉细胞释放的ROS越多、对镉离子的敏感性越强，耐镉性越差；反之，叶肉细胞的耐镉能力越强，通过利用镉胁迫环境中离体叶片活性氧产生的数量与荧光强度的相关性，直观、准确地判断不同基因型水稻的镉敏感性，所需材料少，检测时间短，工作效率高，具有非常广阔的应用前景，对其他植物耐镉潜力的快速鉴定具有重要参考价值。
鉴定水稻镉敏感性的方法，还有另外一种方式，包括以下步骤：
S1.胁迫处理
裁剪不同水稻基因型的离体叶片分别放入不同的试管内，并向试管内滴加等量的镉溶液直至没过离体叶片，离体叶片在镉溶液中进行胁迫处理，叶肉细胞的过氧化氢分布特征在基因型间表现出明显的差异，把离体叶片放在不同浓度的镉溶液中处理48h，然后取出浸泡在含有还原型二氯荧光素 (DCF)的反应罐中孵育10h，DCF中无荧光的乙酸酯基团被叶片中的过氧化氢氧化，生成带电荷的二氯荧光素后对离体叶片进行染色处理；
S2.显微镜观察
将反应罐内的离体叶片放在荧光显微镜下观察离体叶片中的荧光强度和分布特征，就能快速准确地判断基因型的耐镉能力，叶片中绿色荧光斑点越多，说明镉胁迫环境叶片产生的过氧化氢越多、叶肉细胞对镉离子的敏感性越强，耐镉性越差；反之，叶片中绿色荧光斑点越少，叶肉细胞的耐镉能力越强，该技术体系以水稻叶片中的荧光强度和分布特征为依据，鉴别不同基因型的镉敏感性，只需要少量的水稻叶片，且不受水稻大小的限制，能在较短的时间内，快速准确地鉴定出水稻的耐镉能力，具有效率高、重复性好、费用低廉等优点。
鉴定水稻镉敏感性的方法，还有另外一种方式，包括以下步骤：
S1.胁迫处理
裁剪不同水稻基因型的离体叶片分别放入不同的试管内，并向试管内滴加等量的镉溶液直至没过离体叶片，离体叶片在镉溶液中进行胁迫处理，叶肉细胞的O2·-分布特征在基因型间表现出明显的差异，把离体叶片放在不同浓度的镉溶液中处理48h，然后取出浸泡在含有氮蓝四唑(NBT)的反应罐中孵育10h，氮蓝四唑被还原为蓝色的甲腙，在560nm处有最大吸收峰，然后对离体叶片进行染色处理；
S2.显微镜观察
将反应罐内的离体叶片放在荧光显微镜下观察离体叶片中的光斑大小和分布特征，就能快速准确地判断基因型的耐镉能力，叶片中蓝色斑点越多，说明镉胁迫环境叶片产生的O2·-越多、叶肉细胞对镉离子的敏感性越强，耐镉性越差；反之，叶片中蓝色荧光斑点越少，叶肉细胞的耐镉能力越强，根据叶片荧光强度鉴定技术筛选大量对耐镉敏感的基因型，可以有效地压缩田间试验的规模，节约时间和人力，大幅度提高低镉基因型水稻的筛选效率，加快低镉水稻新品种选育的步伐。
不同水稻基因型的离体叶片的裁剪长度为3cm。
镉溶液为氯化镉溶液，其中镉浓度为0.9，4.5，9.0，13.5，18.0μmol·L-1中的一种或多种。
染色处理的详细操作为选择活性氧ROS分析试剂盒二氯二氢荧光素二乙酸酯，对离体叶片进行染色处理，孵育时间10h。
染色处理的详细操作为选择氮蓝四唑(NBT)染色试剂盒，对离体叶片进行染色处理，孵育时间10h。
实施例二：
如图1-2所示，本发明实施例提供一种利用荧光染色技术快速鉴定水稻镉敏感性的方法，包括以下步骤：
S1.胁迫处理
裁剪不同水稻基因型的离体叶片分别放入不同的试管内，并向试管内滴加等量的镉溶液直至没过离体叶片，对离体叶片浸泡6h，离体叶片在镉溶液中进行胁迫处理，叶肉细胞释放大量的活性氧(ROS)，在酶的催化下，活性氧与荧光素反应形成具有荧光的化合物；
S2.显微镜观察
将试管内的离体叶片取出并依次放在荧光显微镜下观察离体叶片中的荧光强度和分布特征，就能区分水稻叶肉细胞的镉敏感性在基因型间的差异，叶片中的荧光斑点越多、荧光面积越大，表明叶肉细胞释放的ROS越多、对镉离子的敏感性越强，耐镉性越差；反之，叶肉细胞的耐镉能力越强，通过利用镉胁迫环境中离体叶片活性氧产生的数量与荧光强度的相关性，直观、准确地判断不同基因型水稻的镉敏感性，所需材料少，检测时间短，工作效率高，具有非常广阔的应用前景，对其他植物耐镉潜力的快速鉴定具有重要参考价值。
鉴定水稻镉敏感性的方法，还有另外一种方式，包括以下步骤：
S1.胁迫处理
裁剪不同水稻基因型的离体叶片分别放入不同的试管内，并向试管内滴加等量的镉溶液直至没过离体叶片，离体叶片在镉溶液中进行胁迫处理，叶肉细胞的过氧化氢分布特征在基因型间表现出明显的差异，把离体叶片放在不同浓度的镉溶液中处理12h，然后取出浸泡在含有还原型二氯荧光素 (DCF)的反应罐中孵育1h，DCF中无荧光的乙酸酯基团被叶片中的过氧化氢氧化，生成带电荷的二氯荧光素后对离体叶片进行染色处理；
S2.显微镜观察
将反应罐内的离体叶片放在荧光显微镜下观察离体叶片中的荧光强度和分布特征，就能快速准确地判断基因型的耐镉能力，叶片中绿色荧光斑点越多，说明镉胁迫环境叶片产生的过氧化氢越多、叶肉细胞对镉离子的敏感性越强，耐镉性越差；反之，叶片中绿色荧光斑点越少，叶肉细胞的耐镉能力越强，该技术体系以水稻叶片中的荧光强度和分布特征为依据，鉴别不同基因型的镉敏感性，只需要少量的水稻叶片，且不受水稻大小的限制，能在较短的时间内，快速准确地鉴定出水稻的耐镉能力，具有效率高、重复性好、费用低廉等优点。
鉴定水稻镉敏感性的方法，还有另外一种方式，包括以下步骤：
S1.胁迫处理
裁剪不同水稻基因型的离体叶片分别放入不同的试管内，并向试管内滴加等量的镉溶液直至没过离体叶片，离体叶片在镉溶液中进行胁迫处理，叶肉细胞的O2·-分布特征在基因型间表现出明显的差异，把离体叶片放在不同浓度的镉溶液中处理6h，然后取出浸泡在含有氮蓝四唑(NBT)的反应罐中孵育1h，氮蓝四唑被还原为蓝色的甲腙，在560nm处有最大吸收峰，然后对离体叶片进行染色处理；
S2.显微镜观察
将反应罐内的离体叶片放在荧光显微镜下观察离体叶片中的光斑大小和分布特征，就能快速准确地判断基因型的耐镉能力，叶片中蓝色斑点越多，说明镉胁迫环境叶片产生的O2·-越多、叶肉细胞对镉离子的敏感性越强，耐镉性越差；反之，叶片中蓝色荧光斑点越少，叶肉细胞的耐镉能力越强，根据叶片荧光强度鉴定技术筛选大量对耐镉敏感的基因型，可以有效地压缩田间试验的规模，节约时间和人力，大幅度提高低镉基因型水稻的筛选效率，加快低镉水稻新品种选育的步伐。
不同水稻基因型的离体叶片的裁剪长度为3cm。
镉溶液为氯化镉溶液，其中镉浓度为0.9，4.5，9.0，13.5，18.0μmol·L-1中的一种或多种。
染色处理的详细操作为选择活性氧ROS分析试剂盒二氯二氢荧光素二乙酸酯，对离体叶片进行染色处理，孵育时间1h。
染色处理的详细操作为选择氮蓝四唑(NBT)染色试剂盒，对离体叶片进行染色处理，孵育时间1h。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
