一种肿瘤细胞标志物miRNA-21的检测方法
技术领域
本发明属于肿瘤检测
技术领域
，具体涉及一种肿瘤细胞标志物miRNA-21的检测方法。背景技术
检测肿瘤进展中与肿瘤相关的核酸标志物动态变化对于准确指导治疗和了解肿瘤发生的机制至关重要。肿瘤相关标志物miRNA的研究表明其表达水平的动态变化与肿瘤进展和预后密切相关。但miRNA的体积小、表达水平低、相似同源家族的序列易于降解，因此细胞内miRNA的水平变化很难被动态监测。
目前用于检测miRNA的传统方法主要有RNA印迹技术、定量即时聚合酶链锁反应、微阵列分析、表面等离子体共振、电化学技术等。虽然这些方法具有高的灵敏度和选择性，但是复杂的样品处理、昂贵的试剂以及冗长的实验时间限制了它们的应用。许多荧光成像技术已经被报道用于原位检测细胞中的miRNA。这些荧光技术具有高分辨率、高选择性以及无创伤等优点，然而，这些方法大多数用于活细胞中miRNA的定性成像，很少有荧光方法用于细胞内miRNA的定量研究。尽管有报道使用多功能金纳米探针以异硫氰酸荧光素荧光作为检测信号的原位定量方法，但是光漂白性、荧光染料的光学不稳定性和背景自发荧光仍然严重限制了miRNA的细胞内定量。
表面增强拉曼散射(SERS)是一种在特殊制备的一些金属导体表面或溶胶中由于样品表面或近表面的电磁场的增强导致吸附分子的拉曼散射信号比普通拉曼散射(NRS)信号显著增强的现象。近年来，因出色的灵敏度、固有的化学指纹信息等，表面增强拉曼散射(SERS)引起了科学界的广泛关注。增强电磁场的纳米级区域随机分布在SERS底物上且非常罕见(<SERS活性位点总数的0.1％)，且分析物不一定位于热点，因此SERS信号的再现性通常很差。近年来，以DNA双链为连接子，以金纳米颗粒为装配体的自组装结构因其可控参数的独特性、DNA的可编程性以及对生物靶标的特异性检测而受到广泛关注。与二聚体相比，核卫星结构(CS结构)经常形成规则的增强电场(热点)阵列，其主要由局域表面等离子共振(LSPR)在CS结构中的耦合形成，可以极大地增强SERS信号的灵敏度。
尽管拉曼成像是一种有应用前景的生物成像技术，但SERS需要较长的光谱采集时间，因此会发生非特异性累积，致使成像图像的边缘不清晰，无法有效指导多效性治疗。在临床诊断中，联合应用不同的光学技术可以利用互补的优势来收集多尺度数据，进行精准的医学诊断。不同诊断模式的机制差异极大地限制了双模式策略的构建，因此建立有效的双模式诊断策略是一项艰巨的挑战。
决定SERS效果的关键因素是可以激发局域等离子基元的位点(活性热点)数量和分布密度。现有技术中选择较少活性热点的金纳米球(AuNP)作为表面增强拉曼散射基底，这会极大的影响SERS灵敏度的提升；此外现有技术中选择额外吸附拉曼报告分子，使得方法步骤繁琐，操作过程难以控制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤细胞标志物miRNA-21的检测方法，该检测方法操作过程方便控制，能够简便、准确、高效地对miRNA-21进行原位成像及定量检测，提升SERS的灵敏度，满足方法验证过程中对灵敏性、特异性等方面的要求。
为实现上述目的，本发明提供了一种肿瘤细胞标志物miRNA-21的检测方法，包括以下步骤：
(1)制备AuNPs探针和GNS探针；
(2)通过步骤(1)制备得到的AuNPs探针和GNS探针对缓冲液中的miRNA-2进行双信号检测；
(3)制备功能化MnO2纳米片；
(4)细胞内miRNA-21的荧光成像与拉曼定量检测。
进一步的，步骤(1)中，制备AuNPs探针的过程为：
搅拌下将质量分数为0.01％的HAuCl4溶液加热至沸腾，并快速添加质量分数为1％的柠檬酸三钠溶液，HAuCl4溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为100：3.5，当溶液的颜色从浅黄色变为无色，再由无色变为酒红色，继续沸腾10min后，搅拌并冷却至室温，使用0.45μm的Millipore膜过滤器过滤溶液后得到AuNPs溶液并保存于4℃条件下；
制备杂交链C1：向10μM 100μL的S1 DNA中添加100nM 1.5μL的TCEP，在室温下激活1h，将活化的S1 DNA与50μM 30μL的F1 DNA和50μM 30μL的Walker DNA混合，加热至75℃并孵育10min，冷却至室温并在黑暗条件下杂交至少12h；制备杂交链C2：向10μM 100μL的S2DNA中添加100nM 1.5μL的TCEP，在室温下激活1h，将活化的S2 DNA与50μM 30μL的F2 DNA和50μM 30μL的Walker DNA混合，加热至75℃并孵育10min，冷却至室温并在黑暗条件下杂交至少12h；将100μL体积比为6：1的C1/C2混合体系添加到2mL的AuNPs溶液中，在25℃下搅拌24h，继续添加10μL质量分数为10％的Tween20溶液，最后添加100μL含2M NaCl的PBS溶液连续3次进行钝化，继续培养20h得到混合溶液；
将混合溶液离心后用10mmol/L Tris HCl缓冲溶液洗涤金纳米颗粒，将金纳米颗粒分散在体积分数为0.02％Tween-20的10mmol/L Tris HCl缓冲溶液中，缓冲溶液的pH为8.0。
进一步的，步骤(1)中，制备GNS探针的过程为：将0.1gPVP溶解在25mL的DEG中，加热直至回流，5min后，注入2mL含20mg HAuCl4·3H2O的DEG溶液，10min后，停止反应并冷却至室温后离心得到二十面体金种子，再将二十面金种子用DMF洗涤两次后分散在27mL的DMF中；
将1.2g PVP溶解在15mL DMF中，加入50μL质量分数为40％的DMA溶液和80μL 2.5M的HCl溶液，再依次添加1mL含二十面体金种子的DMF溶液和20μL的0.5M HAuCl4溶液得到反应溶液；将反应溶液在80℃条件下搅拌4h后离心得到高对称金纳米星GNS，将高对称金纳米星GNS用乙醇洗涤两次后分散在2mL水中得到GNS混合液；
将100μL 10μM的发夹H1 DNA链在95℃水浴中加热5min，然后在冰浴中冷却到室温后，向发夹H1 DNA链中加入1.5μL 100nM的TCEP，将发夹H1 DNA链激活1h；将1mL GNS混合液和100μL 10μM激活后的发夹H1 DNA链混合置于烧杯中，并在37℃摇床中摇动24h，再依次经过离心、洗涤后分散在体积分数为0.02％Tween-20的10mmol/L Tris HCl缓冲溶液中，缓冲溶液的pH为8.0。
进一步的，步骤(2)中，对缓冲液中miRNA-21进行双信号检测：将200μg/ml 1ml分散后的AuNP探针、60μg/ml 1ml分散后的GNS探针以及20μM 100μL的燃料DNA混合后加入到miRNA-21中配制成不同浓度的miRNA-21溶液，并分别在37℃下孵育3h，离心，将上清液用于荧光光谱检测，在492nm的最大激发波长下收集500～600nm的FAM荧光；将沉淀重悬于PBS中，然后将溶液滴到载玻片的表面上，用共聚焦拉曼光谱仪在以下条件下检测样品的拉曼光谱和强度：激光激发波长为633nm，累积时间为10s，扫描时间为10s，激光功率为30mW，范围为400至1700cm-1；重复三次实验，获得荧光光谱和拉曼光谱；燃料DNA由1：1的Fuel 1 DNA和Fuel H DNA混合配制而成。
进一步的，步骤(3)中，制备功能化MnO2纳米片的过程为：在15s内将20mL 0.6M的氢氧化四甲铵和3wt％H2O2的混合水溶液添加到10mL 0.3M的MnCl2溶液中得到的深棕色悬浮液，将深棕色悬浮液在室温下搅拌过夜，离心后将得到的沉淀物依次用蒸馏水和甲醇洗涤，最后于60℃下干燥得到块状二氧化锰；将10mg的块状二氧化锰分散在20mL水中，超声处理后离心得到MnO2纳米片；室温下将MnO2纳米片与20μM 100μL的燃料DNA混合搅拌20min，燃料DNA由1：1的Fuel 1 DNA和Fuel H DNA混合配制而成，然后加入HEPES缓冲液在室温下孵育20min。
优选的，步骤(3)中，所述HEPES缓冲液的浓度为20mM，pH为7.2，其中含有150mM的NaCl和2mM MgCl2。
进一步的，步骤(4)的具体过程为：当细胞处于对数生长期时，在激光共聚焦培养皿中接种1mL细胞浓度为2×104/mL的细胞悬液，细胞贴壁后，于37℃、体积分数5％的CO2条件下，将细胞置于含2mL混合探针的新鲜培养基中分别培养1h、2h、3h、4h、6h，混合探针的制备过程：将浓度60μg/mL的AuNP探针和浓度为200μg/mL的GNS探针分别离心后，重悬于2mL浓度为50μg/mL的功能化MnO2纳米片溶液中；将除去混合溶液后将细胞用PBS洗涤三次，并用4％多聚甲醛固定，再用DAPI将细胞染色，最后再用PBS洗涤两次后进行荧光成像；用共聚焦拉曼光谱仪在以下条件下检测细胞的拉曼光谱和强度：激光激发波长为633nm，累积时间为10s，扫描时间为10s，激光功率为30mW，范围为400至1700cm-1；选择20个细胞用于SERS检测，并计算平均值。
进一步的，以miRNA-21的标准品浓度的lg值与所检测出的拉曼与荧光信号强度作标准曲线，确定回归方程，并模拟细胞内环境验证该回归方程在细胞内的适用性；再通过检测出的各细胞中miRNA-21的拉曼信号强度或荧光信号强度计算出活细胞中miRNA-21的含量。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明利用DNA级联扩增技术使得荧光分析技术与拉曼分析技术相结合，利用双方互补的优势来收集多尺度数据，以进行精准的医学诊断；
(2)靶标触发的核卫星结构自组装，导致大量电磁热点产生，这与DNA介导的低聚体(二聚体或三聚体)相比，核卫星结构能够形成规则的增强电场(热点)阵列，从而极大增强拉曼检测的灵敏度；
(3)本发明通过DNA级联扩增技术选择性的将靶标转换为大量驻留在电磁热点中的腺嘌呤，这确保了分析物位于热点区域中，从而提高了拉曼检测的稳定性。
本发明检测方法操作过程方便控制，能够简便、准确、高效地对miRNA-21进行原位成像及定量检测，提升了SERS的灵敏度，满足方法验证过程中对灵敏性、特异性等方面的要求。
附图说明
图1为实施例制备的复合探针表征图：(A)高对称性金纳米星GNS的透射电子图(TEM)；(B)高对称性金纳米星GNS的高倍数扫描电子图(SEM)；(C)高对称性金纳米星GNS的低倍数扫描电子图(SEM)；(D)金纳米粒子AuNP的透射电子图(TEM)；(E)功能化MnO2纳米片的透射电子图(TEM)；(F)功能化MnO2纳米片、AuNP和GNS的X射线光电子能谱谱图(XPS)；(G)金纳米粒子AuNP的粒径分布图；(H)高对称性金纳米星GNS的粒径分布图；(I)高对称性金纳米星GNS、金纳米粒子AuNP、功能化MnO2纳米片的Zeta电位统计图；(J)高对称性金纳米星GNS、金纳米粒子AuNP的紫外吸收光谱图；
图2为靶标响应性组装性核卫星结构：(A)无靶标存在时；(B)靶标存在时组装的核卫星结构。
图3为对缓冲液中miRNA-21进行双信号检测时，复合探针响应不同浓度的miRNA-21的荧光-拉曼相关谱图：(A)荧光光谱图；(B)荧光强度的散点图；(C)拉曼光谱图；(D)拉曼强度与lgC(miRNA-21)的校准曲线；
图4为DTN对不同细胞的内源性miRNA-21进行双信号检测时，复合探针响应的荧光-拉曼相关谱图：(A)DTN处理后不同细胞的共聚焦荧光显微镜图；(B)DTN处理后不同细胞的荧光流式；(C)DTN处理后不同细胞的荧光位移；(D)DTN处理后不同细胞的拉曼信号光谱；(E)DTN处理后不同细胞的拉曼信号强度的统计分析。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本实施例中用到的MCF-7细胞、肿瘤细胞(hepG2，Hela)和正常细胞(L929，LO2)均购买自中国科学院上海细胞库。
本发明实施例提供的肿瘤细胞标志物miRNA-21的检测方法，包括以下步骤：
(1)制备AuNPs探针和GNS探针；
(2)通过步骤(1)制备得到的AuNPs探针和GNS探针对缓冲液中的miRNA-2进行双信号检测；
(3)制备功能化MnO2纳米片；
(4)细胞内miRNA-21的荧光成像与拉曼定量检测。
本发明实施例提供的肿瘤细胞标志物miRNA-21的检测方法所用到的DNA序列件下表1所示。
表1复合探针制备及实验所需核苷酸序列
以上序列购自上海生物工程有限公司。
本发明实施例提供的肿瘤细胞标志物miRNA-21的检测方法，包括以下具体步骤：
1.制备AuNPs探针：
①在剧烈搅拌下将100mL质量分数为0.01％的HAuCl4溶液加热至沸腾，并快速3.5mL添加质量分数为1％的柠檬酸三钠溶液，当溶液的颜色从浅黄色变为无色，再由无色变为酒红色，继续沸腾10min后，搅拌并冷却至室温，使用0.45μm的Millipore膜过滤器过滤溶液后得到AuNPs溶液并保存于4℃条件下；
②制备杂交链C1：向10μM 100μL的S1 DNA中添加100nM 1.5μL的TCEP，在室温下激活1h，将活化的S1 DNA与50μM 30μL的F1 DNA和50μM 30μL的Walker DNA混合，加热至75℃并孵育10min，缓慢冷却至室温并在黑暗条件下杂交至少12h；制备杂交链C2：向10μM 100μL的S2 DNA中添加100nM 1.5μL的TCEP，在室温下激活1h，将活化的S2 DNA与50μM 30μL的F2DNA和50μM 30μL的Walker DNA混合，加热至75℃并孵育10min，缓慢冷却至室温并在黑暗条件下杂交至少12h；将100μL体积比为6：1的C1/C2混合体系添加到2mL AuNPs溶液中，在25℃下搅拌24h，继续添加10μL质量分数为10％的Tween20溶液，最后添加100μL含2M NaCl的PBS溶液连续3次进行钝化，继续稳定培养20h得到混合溶液；
③为了转移过量的DNA，将混合溶液在13500rpm下离心30min后，用2mL的10mmol/LTris HCl缓冲溶液洗涤金纳米颗粒，将金纳米颗粒分散在体积分数为0.02％Tween-20的1mL 10mmol/LTris HCl(pH 8.0)缓冲溶液中。
2.制备GNS探针：
①将0.1g PVP溶解在25mL的DEG中，加热直至回流，5min后，快速注入2mL含20mgHAuCl4·3H2O的DEG溶液，10min后，停止反应并冷却至室温后离心得到二十面体金种子，再将二十面金种子用DMF洗涤两次后分散在27mL的DMF中；
②将1.2g PVP溶解在15mL DMF中，加入50μL质量分数为40％的DMA溶液和80μL2.5M的HCl溶液，再依次添加1mL含二十面体金种子的DMF溶液和20μL的0.5M HAuCl4溶液得到反应溶液；将反应溶液在80℃的油浴中轻轻搅拌4h后离心得到高对称金纳米星GNS，将高对称金纳米星GNS用乙醇洗涤两次后分散在2mL水中得到GNS混合液；
③在准备GNS探针时，为了防止发夹链的碱基错配，需要将100μL 10μM的发夹H1DNA链在95℃水浴中加热5min，然后在冰浴中冷却到室温后，向发夹H1 DNA链中加入1.5μL100nM的TCEP，将发夹H1 DNA链激活1h；将1mL GNS混合液和100μL 10μM激活后的发夹H1DNA链混合置于干净的10mL小烧杯中，并在37℃摇床中摇动24h，为了除去过量的DNA，再依次经过离心(6000rpm，20min)、洗涤两次后分散在体积分数为0.02％Tween-20的10mmol/LTris HCl(pH 8.0)缓冲溶液中。
3.制备功能化MnO2纳米片：
①在15s内将20mL 0.6M的氢氧化四甲铵和3wt％H2O2的混合水溶液添加到10mL0.3M的MnCl2溶液中，混合后溶液立即变为深棕色，表明Mn2+被氧化为Mn4+；将得到的深棕色悬浮液在室温下搅拌过夜，离心(2000rpm，10min)后将得到的沉淀物依次用大量的蒸馏水和甲醇洗涤，最后于60℃下干燥得到块状二氧化锰；
②为了制备MnO2纳米片，将10mg的块状二氧化锰分散在20mL水中，超声处理10h后离心(2000rpm)得到MnO2纳米片，保留上清液以备进一步使用；室温下将MnO2纳米片与20μM100μL的燃料DNA混合搅拌20min，使得MnO2纳米片对燃料DNA进行物理吸附，燃料DNA由1：1的Fuel 1 DNA和Fuel H DNA混合配制而成，然后加入HEPES缓冲液(20mM，pH 7.2，含有150mM NaCl和2mM MgCl2)在室温下孵育20min。
4.对缓冲液中miRNA-21进行双信号检测：
①将200μg/ml 1ml分散后的AuNP探针、60μg/ml 1ml分散后的GNS探针以及20μM100μL的燃料DNA混合后加入到miRNA-21中配制成不同浓度(0nM、0.2nM、0.5nM、0.8nM、1nM、2nM、10nM、20nM、50nM、100nM、150nM、200nM)的miRNA-21溶液，并分别在37℃下孵育3h，离心，将上清液用于荧光光谱检测，在492nm的最大激发波长下收集500～600nm的FAM荧光；
②使用移液器将沉淀重悬于PBS中，然后将溶液滴到载玻片的表面上，用共聚焦拉曼光谱仪在以下条件下检测样品的拉曼光谱和强度：激光激发波长为633nm，累积时间为10s，扫描时间为10s，激光功率为30mW，范围为400至1700cm-1；重复三次实验，获得荧光光谱和拉曼光谱；燃料DNA由1：1的Fuel 1 DNA和Fuel H DNA混合配制而成。
5.细胞内miRNA-21的荧光成像与拉曼定量检测：
①当细胞处于对数生长期时，在激光共聚焦培养皿中接种1mL细胞浓度为2×104/mL的细胞悬液，细胞贴壁后，于37℃、体积分数5％的CO2条件下，将细胞置于含2mL混合探针的新鲜培养基中分别培养1h、2h、3h、4h、6h，混合探针的制备过程：将浓度60μg/mL的AuNP探针和浓度为200μg/mL的GNS探针分别离心后，重悬于2mL浓度为50μg/mL的功能化MnO2纳米片溶液中；将除去混合溶液后将细胞用PBS洗涤三次，并用4％多聚甲醛固定10min，再用DAPI将细胞染色10min，最后再用PBS洗涤两次后进行荧光成像；
②用共聚焦拉曼光谱仪在以下条件下检测细胞的拉曼光谱和强度：激光激发波长为633nm，累积时间为10s，扫描时间为10s，激光功率为30mW，范围为400至1700cm-1；选择20个细胞用于SERS检测，并计算平均值；
③以miRNA-21的标准品浓度的lg值与所检测出的拉曼与荧光信号强度作标准曲线，确定回归方程，并模拟细胞内环境验证该回归方程在细胞内的适用性；再通过检测出的各细胞中miRNA-21的拉曼信号强度或荧光信号强度计算出活细胞中miRNA-21的含量。以上实验步骤用于检测不同转染物处理的MCF-7中miRNA-21的表达以及不同细胞中miRNA-21的表达水平。
对本实施例所制备的复合探针的表征结果分析如下：
如图1所示运用紫外-可见吸收光谱、电子透射/扫描电镜、粒度分析对高对称性金纳米星(GNS)和金纳米粒子(AuNP)进行表征。如图1(A)所示，透射电镜图结果表明GNS高度对称、大小均一并在PBS缓冲液中具有良好的分散性，平均直径在200nm左右；如图1(B)所示，扫描电镜结果表明GNS高度对称，尖端分明；如图1(C)所示，扫描电镜结果表明GNS可稳定批量合成；如图1(D)所示，表明AuNP呈均匀的球形，排列分散，平均直径约13nm左右；另外，如图1(G)和(H)所示，AuNP/GNS的粒径分布与透射电镜图表现的大小基本一致。
如图1(J)所示，经DNA修饰后的GNS探针的最大紫外-可见吸收峰与GNS相比发生了微小的红移，在619nm出现紫外吸收峰。这是归因于纳米颗粒表面修饰的DNA使纳米颗粒的外层介质发生变化，导致介电常数的增加。相同的，AuNP探针最大紫外-可见吸收峰与AuNP相比发生了微小的红移，在517nm出现紫外吸收峰。
如图1(I)所示，GNS的Zeta电位为-6.3±2.1，GNS machine的Zeta电位为-23.5±3.3，AuNP的Zeta电位为-7.6±1.9，AuNPprobe的Zeta电位为-32.3±4.3，这归因于DNA链含有大量负电荷。Zeta电位的结果进一步表明DNA链与纳米颗粒的成功连接，上述结果显示已成功制备GNS machine和AuNP probe。
通过透射电镜、XPS、紫外吸收光谱和Zeta电位对功能化的MnO2纳米片进行表征。如图1(E)所示，MnO2纳米片呈二维单层片状结构，平均直径在200nm左右。如图1(F)所示，XPS方法进一步证明了MnO2纳米片的成功合成，曲线显示出对应于Mn 2p 1/2(641.7eV)、Mn2p 3/2(653.3eV)和O1s的特征峰(曲线a)。
如图1(I)所示，MnO2纳米片的Zeta电位是-28.7±2.2，吸附Fuel后的Zeta电位是-43.7±3.3，进一步验证了燃料DNA的成功吸附。上述结果表明本实施例成功制备得到了复合探针。
拉曼信号的产生依赖于核卫星结构的组装，因此需验证成功组装的核卫星结构。如图2(B)所示，在靶标存在的情况下核卫星结构被成功组装；如图2(A)所示，当没有靶标存在时，GNS与AuNP均匀散在分布。如图3所示，复合探针与一系列浓度的miRNA-21孵育后，其表现出优异的荧光/拉曼双信号响应性。如图3(A)所示，复合探针响应miRNA-21的荧光强度取决于目标浓度，并且荧光强度随靶标浓度的增加而增加，如图3(B)所示，在0.2-2nM之间获得了几乎线性的关系。在荧光强度和miRNA-21浓度之间获得校准曲线，回归方程为y＝242.940+242.335x，根据检测限(LOD)公式，荧光响应的LOD为47.38pM，R2＝0.977，这使得复合探针具有在体内进行肿瘤成像的潜力。如图3(C)所示，与荧光信号一致，SERS信号也显示出与目标浓度的良好的相关性。如图3(D)所示，在拉曼强度和miRNA-21浓度的对数之间获得校准曲线，回归方程为y＝4321.556+389.313lgC(miRNA-21)，LOD为9.78pM，R2＝0.987。与荧光策略相比，SERS策略具有更低的LOD、更高的灵敏度和固有的高稳定性，因此它具有定量活细胞中miRNA-21的能力。
接下来我们在体外模拟细胞内环境，验证SERS分析的标准曲线是否可以在细胞中应用。将低miRNA-21表达的LO2细胞制备成细胞裂解液，加入一系列浓度的miRNA-21和100μM过氧化氢进行SERS分析。在图3(D)中，验证了体外SERS校准曲线的细胞内适用性。因此，建立的校准曲线可用于细胞内靶标的定量。
miRNA-21在多种癌细胞系中被上调，因此我们添加了肿瘤细胞(hepG2，Hela)和正常细胞(L929，LO2)用来验证DTN定量内源性miRNA-21的能力。如图4(A)所示，肿瘤细胞(HepG2细胞、Hela细胞和MCF-7细胞)可以观察到清晰的荧光信号，相反，在正常细胞(LO2细胞，L929细胞)中，荧光信号强度极其微弱。如图4(B)和图(C)所示，流式细胞术结果与共聚焦成像结果一致，进一步证明了荧光信号强度与miRNA-21在不同细胞系中的表达水平之间的相关性。
如图4(D)和图(E)所示，不同细胞的拉曼信号强度与miRNA-21的浓度具有极好的相关性。正常细胞(L929细胞，LO2细胞)中miRNA-21的拉曼强度显著低于其他三种肿瘤细胞。HeLa细胞、HepG2细胞和MCF-7细胞的拉曼强度分别为945.3±24.9、963.0±12.7和1201.9±28.7。如附图3(B)所示，根据缓冲溶液中的标准曲线，HeLa细胞、HepG2细胞和MCF-7细胞中miRNA-21的浓度分别为2nM、2.5nM和9.7nM。上述细胞系中miRNA-21的浓度与先前文献报道的结果一致，这进一步证实了双信号检测与细胞内miRNA-21浓度之间的高度相关性，并证实了所提出的双模式检测策略可以成功地量化各种细胞系中细胞内miRNA-21的表达水平。
方法比较：此外，此策略的LOD与其他miRNA检测方法相似。
表2.本发明的SERS、Fluorescence检测结果与其他生物传感器的比较(*上标为本发明的检测限)
如表2所示，以AuNP探针为卫星组件、GNS探针为SERS核心基底的SERS+荧光双信号检测方法，能较好地检测出肿瘤细胞中miRNA-21的含量。
