一种联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法
技术领域
本发明涉及生物领域，特别是涉及一种联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法。
背景技术
在淡水和海水养殖过程中，由于致病性微生物、寄生虫或非寄生等因素可导致鱼类诸多疾病，而鱼类皮肤是一道重要的免疫保护屏障，可有效阻止致病菌、真菌、寄生虫以及单胞藻类的感染。受损则会导致出血病、病毒性出血性败血症、上皮囊肿病和痘疥病等疾病发生，严重可导致鱼群大量死亡，对渔业经济及可持续发展造成巨大损失。其中嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血性弧菌、粪球菌以及大肠杆菌等为常见细菌性病害。据报道，嗜水气单胞菌感染会引起氧化应激，增加细胞内活性氧(ROS)以及自由基生成，并激活抗氧化防御机制，从而导致机体损伤；还可刺激非特异性免疫反应，导致线粒体功能受损等，并可能在感染后期诱发细胞凋亡。另外，BANERJE等提出嗜水气单胞菌感染方式为被巨噬细胞主动内吞，细菌依赖宿主蛋白生存，继而改变胞质钙稳态，启动钙蛋白酶的活化，后期促发caspase-3介导的巨噬细胞凋亡。目前嗜水气单胞菌侵袭研究主要基于体外敏感细胞系，包括利用胖头鱥肌肉细胞系(FHM)、虹鳟性腺细胞系(RTG-2)、草鱼肾细胞系(CIK)等细胞系，而利用鱼类上皮细胞研究很少；同时采用传统体外细胞毒性评价表征晚期毒性，对亚细胞及早期损伤的多种重要信号同步捕获及综合评价严重不足，从而对相关机制阐述等存在局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法，以解决上述现有技术存在的问题，可实现鱼类感染细菌、病毒以及寄生虫后早期损伤程度的综合判定；辅助药物对感染细菌、病毒以及寄生虫的鱼类的保护作用及其机制研究，为候选药物筛选以及耐药性研究等提供依据和支撑。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法，包括以下步骤：
获取原代鱼上皮细胞；
所述原代鱼上皮细胞是经传代获取的第一代细胞，再用探针组合对所述第一代细胞进行探针标记和共孵育；
基于高内涵筛选系统，选择不同探针对应的荧光通道，对孵育后的细胞荧光表达量进行定量；
基于标准化欧式距离来构建针对Ca++、ROS和MMP等3个维度对鱼上皮细胞早期损伤综合判定的方法，模型为：
模型中，Ca++ 实验和Ca++ 空白或阴性、MMP实验和MMP空白或阴性、ROS实验和ROS空白或阴性分别表示相应组别的钙离子、线粒体膜电位和氧化应激的平均荧光表达量；SCa++、SMMP和SROS分别表示钙离子、线粒体膜电位和氧化应激相应的标准差。
优选的是，当所述第一代细胞生长汇合至80％～90％时，用活性氧(ROS)、活性钙离子(Ca++)和线粒体膜电位(MMP)探针组合进行同步标记。
优选的是，所述探针组合分别针对ROS、Ca++和MMP，优选Thermo Fisher的CellROX、Calcium Orange和Mito组合或具有同等功能的探针及组合。
优选的是，所述CellROX、Calcium Orange和Mito工作液最佳浓度分别为5μM、100nM和100nM。
优选的是，所述探针标记还包括Hoechst，用所述Hoechst标记细胞核，以定位细胞。
优选的是，所述Hoechst最佳工作浓度为1mg/mL。
优选的是，孵育条件为：避光室温或37℃下孵育20～40min。
本发明还提供所述的分析方法在研究鱼类感染细菌、病毒以及寄生虫后的早期损伤程度筛查与判定中的应用。
本发明还提供所述的分析方法在研究药物对感染细菌、病毒以及寄生虫鱼类的保护作用及其机制中的应用。
本发明还提供所述的分析方法在防治鱼类感染细菌、病毒以及寄生虫的候选药物筛选及耐药性研究中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开的联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法，主要基于高内涵筛选系统(High Content Screening,HCS)，以鱼上皮细胞作为体外研究载体，开发适合鱼上皮细胞培养、探针同步标记及评价活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)及活性钙离子(Ca++)亚细胞信号的整套综合分析方法。通过实例证明，该方法通量极高，可有效支撑防治鱼类感染细菌候选药物的筛选，同时还可辅助判定复合使用候选药物是否呈现联合效应(协同、拮抗或加和效应)等。因此，本发明构建一整套可实现鱼类感染细菌、病毒以及寄生虫后诱导早期损伤程度的综合判定程序；为研究药物对感染细菌、病毒以及寄生虫的鱼类的保护作用及其机制提供方法，为候选药物筛选以及耐药性研究等提供支撑。
附图说明
为更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为新霉素(Neo)+百里香酚(Thy)处理“草鱼上皮细胞+嗜水气单胞菌”后的高内涵筛选(HCS)显示荧光强度变化图像；
图2为草鱼上皮细胞及其感染嗜水气单胞菌模式单一及共暴露新霉素(Neo)、百里香酚(Thy)下MMP、ROS和Ca++相对荧光表达水平。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言显而易见。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言显而易见。本申请说明书和实施例仅为示例性。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法
1、原代鱼上皮细胞培养
(1)制备培养液：于小管中加入100μL 10mM、pH 7.6的Tris溶液，得到0.1mg/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的储备溶液，取25μL加入75μL缓冲液HEPE进行稀释，0.22μm滤菌器过滤；5mL的DMEM培养基中添加10mL胎牛血清，1mL青霉素-链霉素溶液，175.3μL 2-ME和以上bFGF滤液；
(2)鱼上皮组织取样：选取500g左右的健康鱼，禁食24h，用2-苯氧乙醇麻醉后置于70％乙醇中消毒1min；于无菌室中取出鳃和中段肠道(剪除肠系膜，纵行剪开肠壁)，置于含青霉素、链霉素的PBS中。转移至细胞间，0.1％次氯酸钠处理3min，无菌蒸馏水洗4次，70％乙醇清洗1min，PBS清洗数次，剪成1mm×1mm组织块备用；
(3)组织块培养：在上述步骤得到的组织块中加入0.25％胰蛋白酶，于28℃水浴中震荡消化20min，并用吸管反复吹打直到光镜下出现大量细胞及细胞团，加入DMEM培养基终止消化。用100目灭菌滤网过滤，再于1000r/min离心5min，弃去上清液，加入培养液制得细胞悬液，接种于5mL培养瓶中，于25℃、5％CO2培养箱中培养90min后，把培养液连同未贴壁细胞转入新的培养瓶继续培养；
(4)鼠尾胶原溶液配置：上述培养所用的培养瓶或孔板需提前包被。具体提前12～24h配置好0.1M醋酸溶液，高压蒸汽灭菌待用；以0.1M醋酸为溶剂，配制浓度为1mg/ml鼠尾胶溶液(最好采用sigma的C7661)，配制过程不断震荡，放置3～4h后备用。配好的鼠尾胶原分装时，底部先加分装容器体积1/5的氯仿垫底；
(5)孔板包被：包被需同时满足10～15μg/cm2浓度以及70μl～80μl/cm2体积水平，因此包被前需根据选择不同6孔板、24孔板、96孔板或培养瓶等进行恰当倍数稀释，同时稀释溶液选择30％浓度酒精；包被后需过夜放置，次日用无菌PBS洗三遍后待用；
(6)鱼上皮细胞纯化：待细胞接种至包被的板子，待其覆盖80％板底表面积(48h)，得到原代培养的上皮细胞。采用反复贴壁法，将得到的上皮细胞经过滤、计数调整细胞密度至5×104/mL接种于培养瓶中，置于培养箱中培养，待细胞覆盖80％板底，重复2次；去掉培养基，用PBS清洗，随后加入0.25％胰蛋白酶消化，于显微镜下观察80～90％细胞回缩时加入DMEM培养基终止，得到纯化后的鱼上皮细胞；
(7)传代培养：将上述纯化后的细胞反复吹打和离心，提高原代上皮细胞驯化以及抗应激能力，待细胞自然纯化，即优势细胞将不占优势，细胞群势消灭；原代上皮细胞用培养液清洗细胞2～3遍，弃去上清液，重悬细胞，隔日更换培养液。使用时最好选用第2～5代处于生长对数期的原代细胞用于实验；
(8)细胞株稳定培养：从原代培养细胞中获得稳定培养特性的细胞株或分化为有限性细菌系，培养、传代和复苏方式遵循常规方式进行。
2、组合探针选择、标记以及上样
(1)上皮细胞准备：第一代细胞生长汇合至80％左右，制备浓度为105个/mL的细胞悬液，充分吹打混匀后接种至黑色96孔板，每孔150μL，即每孔接种104个细胞。将细胞培养板置于培养箱中过夜；加入荧光探针混合液前应将板子中培养液吸出；
(2)探针组合选择：针对活性氧(ROS)、活性钙离子(Ca++)和线粒体膜电位(MMP)3项早期损伤敏感靶标，优选探针组合分别为CellROX(Ex/Em 504/529nm)、Calcium Orange(Ex/Em 549/576nm)和Mito(Ex/Em579/599nm)，同时基于Hoechst(Ex/Em 361/486nm)标记细胞核，以定位细胞；
(3)探针标记及共孵育：探针稀释溶液为PBS；优化后Hoechst(Ex/Em361/486nm)最佳工作浓度为1mg/ml，而CellROX(Ex/Em 504/529nm)、Calcium Orange(Ex/Em 549/576nm)和Mito(Ex/Em 579/599nm)工作液最佳浓度分别为5μM、100nM和100nM；然后将稀释的探针逐次加入已在28℃预热下的DMEM培养基中以制备荧光探针的混合物，过程中全程注意避光；每孔中加入含探针混合物料溶液150μL，同样避光室温或37℃下孵育30min后，弃掉染色液，并用PBS缓冲液清洗2次；
(4)板子固定：板子中每孔加入100μL的4％的多聚甲醛进行固定15min，然后吸出；再采用0.2％的Triton X-100PBS孵育10min，吸出上机待测。
3、高通量测定
利用高内涵筛选仪器进行荧光的定量测定，测试时选择探针对应的激发光荧光通道，首先以20×物镜随机选择视野观察并筛选孔中最佳视野(一般10个视野)；具体结果表达可选择40×物镜下筛选表型好的相应视野，对结果进行定性；于20×物镜，在该孔下相应10个视野中代表不同信号不同通道表达的荧光信号进行定量。结果以三次平行试验下所有10个视野中相应通道总的荧光强度平均至每个细胞的荧光表达强度来进行量化，结果最终以上述荧光强度定量的实验值相对于空白值百分比表征。
4、结果分析
基于标准化欧式距离构建Ca++、ROS和MMP等3个维度对鱼上皮细胞早期损伤的综合判定模型进行计算和分析。对照为阳性组，研究药物使用对“细菌(真菌、寄生虫等)+鱼上皮细胞”的保护作用，如d(x,y)数值越大则表明综合药物对感染细菌(真菌、寄生虫等)后细胞的综合保护作用越强；对照为空白组，研究药物使用对鱼上皮细胞的早期损伤综合效应，如d(x,y)数值越大则表明药物对细胞的毒性效应越强。模型如下：
模型中，Ca++ 实验和Ca++ 空白或阴性、MMP实验和MMP空白或阴性、ROS实验和ROS空白或阴性分别表示相应组别的钙离子、线粒体膜电位和氧化应激的平均荧光表达量；SCa++、SMMP和SROS分别表示钙离子、线粒体膜电位和氧化应激相应的标准差。
实施例2联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法应用案例
该实施例主要基于“新霉素(Neo)+百里香酚(Thy)”组合，探究在“嗜水气单胞菌+鱼类上皮细胞”体系中，该组合是否能有效控制细菌增殖的同时不对鱼类上皮细胞带来严重损伤。具体操作方式如下：
1.抗菌药物组合溶液的配制：采用DMEM培养基稀释抗菌药物至所需浓度，新霉素(Neo)药物单一浓度为9.78μg/mL以及百里香酚(Thy)药物单一浓度为204.56μg/mL，“Neo+Thy”混合浓度以各自0.5倍浓度进行混合；
2.嗜水气单胞菌液制备：以LB培养基将处于对数生长期期间的嗜水气单胞菌调节至OD＝0.1(约为107CFU/mL)，备用；
3.草鱼上皮细胞准备：准备草鱼上皮细胞，当细胞生长汇合至80％左右，制备成浓度为105个/mL的细胞悬液，充分吹打混匀后接种至黑色96孔板，每孔100μL，即每孔接种104个细胞，并在培养箱中过夜；
4.高通量筛选分析：将上述制备的细菌悬液按照体积比为1:1000添加至含有单一或组合药物的DMEM培养基中(即细菌菌液：含有单一或组合药物的DMEM培养基体积比为1:1000)。弃掉96孔板中旧的培养基，每孔加入100μL上述DMEM培养基(细菌与细胞的比例约为20:1)。对照组包括未感染的细胞，以及未添加药物但进行细菌感染的细胞，每组设置5孔作为平行。ROS、Ca++和MMP是细菌感染诱导的早期损伤指标，其晚期损伤终点为细胞凋亡，但只有在细胞膜仍完好时才可测量，因此在处理3h后更换荧光探针混合物，于28℃共孵育40min，弃液，用PBS清洗2～3次。上述过程均在避光条件下操作。选择适当荧光通道，20×物镜下，每孔选取10个视野，计算ROS，Ca++和MMP强度，进行三次独立重复试验验证试验结果。结果如图1和图2所示。
基于上述模型计算出单一药物Try和Neo及二元组合“Neo+Try”相应d(x,y)结果，以判定早期损伤程度的综合风险，同时初判探明单一及二元药物组合之间是否存在联合效应。
(1)与阳性对照相比，即“嗜水气单胞菌+草鱼上皮细胞”模型下，单一及联合用药的d(x,y)计算如下：
①Neo单一作用方式：
d(x，y)＝2.834
②Try单一作用方式：
d(x，y)＝2.719
③“Neo+Try”联合作用方式：
d(x，y)＝2.779
依据上述计算结果显示：①单一及“Try+Neo”二元药物组合对感染嗜水气单胞菌的上皮细胞保护能力由强至弱依次排序为：Neo>Try+Neo>Try；②联合用药组“Try+Neo”呈现相加作用或弱协同(弱拮抗)效应。
(2)与空白对照相比，即草鱼上皮细胞模型下，单一及联合用药的d(x,y)计算如下：
①Neo单一作用方式：
d(x，y)＝1.992
②Try单一作用方式：
d(x，y)＝1.333
③“Neo+Try”联合作用方式：
d(x，y)＝3.510
依据上述计算结果显示：①单一及“Try+Neo”二元药物组合对草鱼上皮细胞毒性效应由强至弱依次排序为：Try+Neo>Neo>Try；②联合用药组“Try+Neo”同样呈现协同或弱协同效应。
鉴于上述结果，优选顺序为Neo、Try+Neo和Try，理由为Neo对草鱼上皮细胞毒性处于中等水平，但其对染菌后细胞的保护作用最强，综合权重使用策略最优；其次为联合用药组Try+Neo，其对染菌细胞的保护作用处于中等水平，但对细胞毒性最高，同时可能呈现了协同效应；Try为天然活性成分，其对染菌后细胞的保护作用不显著，同时对细胞的毒性也最低。进一步可针对Try+Neo和Try进行更为深入的研究，以明确二者之间哪种为更为优选的替代方案。该结果同时也实践和证明了本发明对细胞早期损伤综合诊断、用药方案的筛选、相关机理机制研究等具有很好的支撑作用，且通量极高。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
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