具体实施方式

本发明的发明原理如下：

图1中，Phosphate表示磷酸根离子(PO4^3-)；Porphyrin表示卟啉；G-quadruplex表示G-四链体DNA；

结合图1，G-四链体DNA可以催化铜离子插入到卟啉中形成金属卟啉。卟啉本身带有微弱的荧光，同时它的荧光可以被G-四链体DNA所提高；而金属卟啉没有荧光，即使加入G-四链体DNA，荧光也不会增加。磷酸根离子可以和铜离子产生强烈的螯合作用，阻止卟啉金属化的发生，从而阻止荧光猝灭，使荧光得到恢复。因此，磷酸根离子在不存在的情况下，卟啉金属化可在G-四链体的催化下发生，形成Cu²⁺-卟啉。因为Cu²⁺-卟啉没有荧光，所以即使在存在G-四链体的情况下，荧光也不会增强。因此，没有观察到荧光。当添加磷酸根离子时，其可与Cu²⁺结合，从而减少溶液中游离Cu²⁺的数量。因此，部分卟啉不能形成Cu²⁺-卟啉。这部分游离的卟啉可与G-四链体DNA结合以发出强荧光。随着磷酸根离子的增加，荧光强度将相应增加，因此通过荧光强度的变化可以检测到磷酸根离子的含量。

基于上述发明原理，本具体实施方式提供了一种磷酸根离子的检测方法，包括以下步骤：

S0、获取含有铜离子的缓冲溶液中的最佳铜离子浓度，具体地，设置不同浓度梯度的Cu²⁺溶液，然后向不同浓度的Cu²⁺溶液中分别添加相同量的N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ和G4DNA到Cu²⁺溶液中，充分混合并反应完全，之后用荧光分光光度计扫描550-700nm的荧光发射光谱，激发波长为399nm，根据Cu²⁺浓度变化与荧光信号变化的关系得到最佳铜离子浓度；

S1、将不同已知浓度的磷酸盐溶液分别加入到含有铜离子的HEPES缓冲溶液中在20-25℃下反应1-2小时形成多组磷酸根-铜离子混合液；所述不同已知浓度的磷酸盐溶液中磷酸盐的浓度分别为：0、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM、1.4μM、1.6μM、1.8μM、2.0μM、2.5μM和3.0μM；

S2、将G-四链体DNA、KCl和卟啉分别添加至步骤S1得到的多组所述磷酸根-铜离子混合液中并检测615nm处的荧光值；所述卟啉优选为N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ；所述G-四链体DNA的序列为：5’-GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG-3’；

S3、根据磷酸根离子的浓度与对应的荧光值建立线性关系；所述线性关系为Y＝83717+1.167×106X(R²＝0.996)，其中，Y表示荧光值，X表示磷酸根离子的浓度；

S4、向待测液中加入含有铜离子的缓冲液重复步骤S1-S2测得615nm处的荧光值，并结合线性关系得到所述待测液中磷酸根离子的浓度。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本实施例的内容主要包括：卟啉金属化的最佳卟啉选择；铜离子浓度的优化；方法的灵敏度和线性检测范围；方法的选择性；对磷酸根加标的自然模拟水样中的磷酸根含量进行回收率分析。

(1)卟啉金属化的最佳卟啉选择

探究适合G-四链体催化的金属化卟啉以达到最佳荧光恢复效果。

我们选取金属化过程常用的NMM(N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ)，MPIX(中卟啉Ⅸ)，PPIX(原卟啉Ⅸ)，TMPyP(5,10,15,20-四(1-甲基-4-吡啶基)卟啉四(对甲苯磺酸盐))四种卟啉化合物，分别设置4组实验组：1.卟啉；2.卟啉+G4 DNA；3.卟啉+G4 DNA+铜离子；4.卟啉+G4DNA+铜离子+磷酸根离子。每组样品于室温避光环境下反应40分钟，充分反应后，每组样品取200μL加入到光径为4mm的微量比色皿中，利用SpectraMax iD3多功能酶标仪测量样品在550-700nm处的荧光发射光谱。其中，体系中各组分浓度：DNA(500nM)，NMM(3μM)，PPIX(3μM)，MPIX(0.3μM)，TMPyP(0.6μM)，Cu²⁺(4μM)，磷酸根(1μM)；所用缓冲液为40mM的HEPES缓冲液中(pH 7.0，25mM KCl，100mM NaCl)。所用G4为(5’-GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG-3’。

四种卟啉的结构式如下(a为NMM，b为MPIX，c为PPIX，d为TMPyP)：

结果如图2所示，四种游离的卟啉都有荧光信号；当加入G4DNA(即G-四链体DNA)后，卟啉的荧光都有所上升，NMM的上升幅度最大，MPIX其次，而G4 DNA对PPIX和TMPyP两种卟啉荧光的增加作用有限。随后，加入铜离子，产生卟啉金属化，四种卟啉的荧光均降低。当加入磷酸根离子后，NMM组的荧光恢复幅度最大。因此，我们选择NMM这种卟啉，进行后续的实验。

(2)铜离子浓度的优化

根据发明原理，Cu²⁺的浓度是磷酸盐检测的一个关键因素。因此，可通过获得不同Cu²⁺浓度下的荧光变化来优化Cu²⁺浓度。设置不同浓度梯度的Cu²⁺溶液，Cu²⁺溶液的浓度分别为0、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM，然后添加相同量的NMM和G4 DNA到Cu²⁺溶液中，DNA的浓度为250nM，NMM的浓度为3μM，充分混匀后于室温避光下反应2小时后用荧光分光光度计扫描550-700nm的荧光发射光谱，激发波长为399nm。结果如图3，随着Cu²⁺浓度的增加，荧光信号逐渐降低。当Cu²⁺浓度增加到4μM时，荧光变化变得缓慢，荧光信号达到平稳状态。此外进一步探究了更高的浓度的铜离子(最高8μM)，荧光信号仍然几乎没有变化。且由于过量的Cu²⁺会影响方法的灵敏度，因此在以下实验中选择了4μM Cu²⁺作为金属化的最佳用量。

(3)方法的灵敏度和线性检测范围；

首先，我们把不同浓度的磷酸根加入到含有4μM铜离子的40mM的HEPES缓冲液中(pH 7.0，25mM KCl，100mM NaCl)。充分混匀，25℃反应1小时。然后，把250nM DNA，10mM KCl和3μM NMM加入到上述的磷酸根-铜离子混合液中。充分混匀后室温下避光反应40分钟。最后，用SpectraMax iD3多功能酶标仪记录光谱变化。结果如图4a和4b所示，随着磷酸根加入量的提高，体系荧光恢复量逐渐增大，当磷酸根离子的浓度从0μM增加到约1μM时，荧光恢复量达到饱和状态，继续增加磷酸根荧光几乎不再变化。从图4b中的插图，我们发现最大发射波长615nm处的荧光值与磷酸盐(具体为磷酸三钠Na₃PO₄)浓度在0-1.0μM范围内具有良好的线性关系。分析得出线性方程为Y＝83717+1.167×106X(R2＝0.996)，其中Y和X分别表示荧光值和磷酸根离子的浓度。这表明设计的方法可以定量检测磷酸根离子。最后基于公式3α/斜率，检测限估计为0.044μM(44nM)。(α为标准偏差，其通过测量多组空白溶液在615nm下的荧光值来计算得到)。

(4)方法的选择性；

通过比较不同阴离子的响应以验证磷酸根离子检测的选择性这一指标。将终浓度2μM的磷酸根溶液和2μM其他干扰物质(CO₃ ^2-，SO₄ ^2-，SO₃ ^2-，NO₃ ^-，Cl^-，Br^-，H₂O)分别与4μM铜离子混合后，于室温下反应1小时，将各组混合液分别添加到含有250nM DNA和3μM NMM的体系中，室温避光下反应40分钟后用SpectraMaxiD3多功能酶标仪记录荧光变化，如图5所示，通过记录615nm处的荧光发射峰变化，发现相较于磷酸根离子，其他几组干扰物质对应的荧光恢复量极低，而磷酸根所在的体系荧光恢复量明显高于其他组，大约60倍，表明该方法对磷酸根离子的选择性优异。

(5)磷酸根加标的模拟水样的回收率分析；

首先选取长江大学校园中池塘水作为实际水样，通过标准颁布的液相色谱法测定并排除了该水样中磷酸盐的可测得含量，经过0.22μm滤膜过滤以除去水样中不溶性杂质，然后添加不同浓度的磷酸根(0.2μM，0.5μM和0.8μM)，制成含有精确含量的磷酸根标准样品，通过与方法的灵敏度滴定实验一致的过程测量该水样对体系荧光的恢复量，然后，通过上述线性回归方程式定量测量磷酸盐浓度，并计算了回收率。

结果如表1所示，计算得到该方法检测实际水样中的磷酸根离子，回收率在94％-106％之间，可以用于实际样品的检测。

本发明操作简单、便捷高效、无需进行荧光标记且可应用于实际样品的检测，为检测自然环境中的磷酸根离子提供了一种新的思路。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。