一种近红外光片显微镜
技术领域
本发明涉及光学显微镜
技术领域
，尤其涉及一种近红外光片显微镜。背景技术
光学显微镜是生物医学研究中最基本的研究工具，是现代生物学得以建立和发展的重要基础。目前，光学显微镜已发展成多种类型，如常用的普通光学显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等。其中，荧光显微镜由于其可以对特定标记目标进行成像，已经成为在分子生物学及生物组织研究中重要的成像工具。然而，实验室中常用的荧光显微镜都是在可见光波段(400-700nm)进行成像，众所周知，很多生物体都是不透明的，可见光在生物组织内的穿透性很差，因此，可见光波段的荧光成像只能用于离体细胞、薄片组织和透明生物的成像，这就大大限制了荧光显微技术在活体组织内的应用。
近红外荧光成像是近年来新兴的一种荧光成像技术，它在近红外波段(800-1700nm)进行成像，由于近红外光的波长，散射低，在生物组织中的穿透深度更大，因此可以满足哺乳动物活体模型中高分辨率成像的需求，这使得近红外荧光成像成为化学、生物学、医学等领域的研究热点。但是，近红外荧光成像较大的成像深度又带来了新的问题，在普通的明场照明、成像系统中，可以同时拍摄到不同深度的荧光图像，这些不同深度的图像叠加在一起无法分辨所采集到信号的深度，这就使得研究人员迫切需要一种能够实现断层成像的近红外荧光成像系统。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例的目的是提供一种近红外光片显微镜，能够对正置的固定样本进行快速三维断层扫描成像。
本发明实施例提供了一种近红外光片显微镜，包括激发光源系统、空间滤波系统、定向扩束系统、多面体扫描转镜、激发物镜、接收物镜、套筒透镜、滤光片及相机，所述激发物镜与竖直方向的夹角成45°，所述接收物镜与竖直方向的夹角成45°；所述激发光源系统产生的激发光束经过所述空间滤波系统滤波后，然后经过所述定向扩束系统在一个方向上扩展，然后经过所述多面体扫描转镜反射到所述激发物镜产生光片，所述光片照射到样品上产生响应光束，所述响应光束经过所述接收物镜、所述套筒透镜及所述滤光片后在所述相机成像。
可选地，所述激发光源系统包括激光器、光纤耦合器及光纤准直器，所述激光器产生的激发光束由所述光纤耦合器导入光纤，再经过所述光纤准直器引入光路。
可选地，所述激发光束的波长包括660nm、785nm、808nm、975nm、1064nm、1319nm及1450nm中的一种或多种。
可选地，所述光纤准直器的波长范围在633～1550nm之间，数值孔径在0.15～0.56之间，焦距在4～38mm之间，光束直径在0.5～8mm之间。
可选地，所述空间滤波系统包括依次排列的第一消色差透镜、精密针孔及第二消色差透镜，所述精密针孔位于所述第一消色差透镜及所述第二消色差透镜的焦距处，所述精密针孔的孔径在10～1000μm之间，所述第一消色差透镜及所述第二消色差透镜的焦距范围在30～200mm之间。
可选地，所述定向扩束系统包括依次排列的第一可调机械狭缝、柱面透镜、第三消色差透镜、第二可调机械狭缝及第四消色差透镜，所述第三消色差透镜与所述第四消色差透镜之间的距离等于所述第三消色差透镜与所述第四消色差透镜的焦距之和，所述第二可调机械狭缝位于所述第三消色差透镜与所述第四消色差透镜的焦点位置，所述第三消色差透镜及所述第四消色差透镜的焦距范围在30～200mm之间。
可选地，所述柱面透镜为平凸或双凸透镜，形状为圆形或矩形，焦距在50～1000mm之间，镀有增透膜，透光范围在350～1620nm之间。
可选地，所述接收物镜与所述套筒透镜之间的距离等于所述套筒透镜的瞳距，所述套筒透镜与所述相机之间的距离等于所述套筒透镜的工作距离；其中，所述套筒透镜的工作距离60～180mm之间，波长范围在400～2000nm之间，瞳距范围在0～170mm之间，厚度范围在25～210mm之间。
可选地，所述激发物镜及所述接收物镜的倍率为4X、5X、10X或20X，波长范围在480～1800nm之间，工作距离在15～40mm之间，数值孔径在0.13～0.4之间。
可选地，所述相机为InGaAs相机，感光芯片为InGaAs阵列，分辨率为320*256或640*512，像元尺寸为10μm、15μm或20μm，帧速率大于或等于50Hz，响应波长范围在900～1700nm之间，暗电流小于或等于150e-，读出噪声小于或等于50e-。
实施本发明实施例包括以下有益效果：本发明实施例通过激发光源系统产生激发光束，通过空间滤波系统对激发光束进行过滤，通过定向扩束系统对滤波后的激光光束进行扩展，通过多面体转镜改变激光光束的入射角度，从而实现在样品和物镜都不移动的条件下，对样品进行快速三维断层扫描成像；另外，激发物镜和接收物镜与竖直方向夹角均为45°且两者相互垂直，从而实现对正置的样品进行断层扫描。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种近红外光片显微镜的结构示意图；
图2是本发明实施例提供的一种采用近红外光片显微镜对样品的脑内血管成像的结果图；
图3是本发明实施例提供的一种采用近红外光片显微镜对样品的大脑成像的结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明。对于以下实施例中的步骤编号，其仅为了便于阐述说明而设置，对步骤之间的顺序不做任何限定，实施例中的各步骤的执行顺序均可根据本领域技术人员的理解来进行适应性调整。
本发明实施例提供了一种近红外光片显微镜，包括激发光源系统、空间滤波系统、定向扩束系统、多面体扫描转镜、激发物镜、接收物镜、套筒透镜、滤光片及相机，所述激发物镜与竖直方向的夹角成45°，所述接收物镜与竖直方向的夹角成45°；所述激发光源系统产生的激发光束经过所述空间滤波系统滤波后，然后经过所述定向扩束系统在一个方向上扩展，然后经过所述多面体扫描转镜反射到所述激发物镜产生光片，所述光片照射到样品上产生响应光束，所述响应光束经过所述接收物镜、所述套筒透镜及所述滤光片后在所述相机成像。
具体地，如图1所示，激发光源系统1产生的激发光束由反射镜M1反射进入空间滤波系统进行滤波，空间滤波系统沿光轴方向依次包括第一消色差透镜2-1、精密针孔2-2及第二消色差透镜2-3；激发光束经过空间滤波系统滤波后进入定向扩束系统进行扩展，定向扩束系统沿光轴方向依次包括第一可调机械狭缝3-1、柱面透镜3-2、第三消色差透镜3-3、第二可调机械狭缝3-4及第四消色差透镜3-5；经过扩展的激发光束由反射镜M2反射到多面体扫描转镜4，经过多面体扫描转镜4反射到激发物镜5产生不同角度光片，光片照射到样品实验鼠上产生响应光束，响应光束经过接收物镜6、套筒透镜7及滤光片8后在相机9成像。
可选地，所述激发光源系统包括激光器、光纤耦合器及光纤准直器，所述激光器产生的激发光束由所述光纤耦合器导入光纤，再经过所述光纤准直器引入光路。
具体地，带光纤耦合器的接口为SMA或FC/PC；光纤接口为SMA或FC/PC，芯直径在50～200μm之间，数值孔径在0.1～0.5之间，透过波长范围在400～2200nm之间。
需要说明的是，激光器产生的激发光由光纤耦合器导入光纤，再通过光纤准直器引入光路，可以通过将光纤与多个激光器连接实现激发光波长的快速切换。
可选地，所述激发光束的波长包括660nm、785nm、808nm、975nm、1064nm、1319nm及1450nm中的一种或多种。
具体地，激光器的功率范围在1～12000mW之间，激发光束的波长由所使用的激光器波长决定，激光功率密度亦可通过激光器激发电流调节，可调节范围由所选取的激光波长决定，如660nm激光的功率密度调节范围是0～0.2W cm-2，785nm激光的功率密度调节范围是0～0.3W cm-2，808nm激光的功率密度调节范围是0～0.33W cm-2，975nm激光的功率密度调节范围是0～0.71W cm-2，1064nm和1319nm激光的功率密度调节范围是0～1W cm-2，1450nm激光的功率密度调节范围是0～0.1W cm-2。
可选地，所述光纤准直器的波长范围在633～1550nm之间，数值孔径在0.15～0.56之间，焦距在4～38mm之间，光束直径在0.5～8mm之间。
具体地，光纤准直器接口为SMA或FC/PC。
可选地，所述空间滤波系统包括依次排列的第一消色差透镜、精密针孔及第二消色差透镜，所述精密针孔位于所述第一消色差透镜及所述第二消色差透镜的焦距处，所述精密针孔的孔径在10～1000μm之间，所述第一消色差透镜及所述第二消色差透镜的焦距范围在30～200mm之间。
具体地，精密针孔的材质为不锈钢、钨或镀金铜中的任意一种，外壳直径为0.5或1英寸，孔径范围在10～1000μm之间。精密针孔的孔径为1.3λf/r，其中，λ为激发光波长，f为第一消色差透镜的焦距，r为入射光斑半径。
具体地，第一消色差透镜及第二消色差透镜的直径范围在0.5～2英寸之间，镀有增透膜，透光范围在400～1700nm之间。
需要说明的是，空间滤波系统可以滤掉杂散光和多级衍射光，从而获得纯净的高斯光束。
可选地，所述定向扩束系统包括依次排列的第一可调机械狭缝、柱面透镜、第三消色差透镜、第二可调机械狭缝及第四消色差透镜，所述第三消色差透镜与所述第四消色差透镜之间的距离等于所述第三消色差透镜与所述第四消色差透镜的焦距之和，所述第二可调机械狭缝位于所述第三消色差透镜与所述第四消色差透镜的焦点位置，所述第三消色差透镜及所述第四消色差透镜的焦距范围在30～200mm之间。
具体地，第三消色差透镜及第四消色差透镜的直径范围在0.5～2英寸之间，镀有增透膜，透光范围在400～1700nm之间。
可选地，所述柱面透镜为平凸或双凸透镜，形状为圆形或矩形，焦距在50～1000mm之间，镀有增透膜，透光范围在350～1620nm之间。
需要说明的是，使用第一可调机械狭缝控制光束在一个方向上的宽度，然后通过柱面透镜扩展光束在该方向上的宽度，因此第一可调机械狭缝可以用于调节光片的宽度。另外，使用两个消色差透镜扩大激发光束，这两个消色差透镜之间的距离等于二者的焦距之和，在两个消色差透镜之间，两个消色差透镜的焦点位置上放置第二可调机械狭缝，使其方向上与光束扩展方向垂直，因此第二可调机械狭缝可以用于调节光片的厚度和激发光路的有效数值孔径。
具体地，多面体扫描转镜的镜面为8～12面，带有旋转电机，转速为0～500Hz，使用空气轴承或滚珠轴承。
需要说明的是，角扫描速率决定于多面体扫描转镜的面数和转镜的转速，角扫描速率可以在0～160rad s-1内调节，转镜的面数越多，转速越快，角扫描速率越高。角扫描范围决定于多面体扫描转镜的面数，8面转镜的角扫描范围为45°，12面转镜的角扫描范围为30°。角扫描速率与扫描范围需与InGaAs相机的采集速率相匹配，即多面体扫描转镜需与InGaAs相机同步控制。
可选地，所述激发物镜及所述接收物镜的倍率为4X、5X、10X或20X，波长范围在480～1800nm之间，工作距离在15～40mm之间，数值孔径在0.13～0.4之间。
需要说明的是，接收物镜的放大倍率一般为激发物镜的2倍。
需要说明的是，激发物镜与竖直方向的夹角成45°，接收物镜与竖直方向的夹角成45°，即激发物镜与接收物镜相互垂直。
需要说明的是，激发光片的厚度和形状决定于所使用的激发物镜的倍率以及激光波长，激发光片厚度(即腰宽)可以在9～30μm范围内调节，光片的长度(即瑞利范围的2倍)可以在0.2～2.5mm范围内调节，激发物镜的倍率越小，激光波长越长，光片厚度越大，长度越长。激发光路的有效数值孔径决定于所使用物镜的焦距和光片宽度，可以在0.035～0.2之间调节，物镜焦距越短，光片越宽，有效数值孔径越大。
需要说明的是，成像分辨率决定于所使用接收物镜的倍率和所接收光的波长，垂直于光片方向的分辨率可以在2～10μm范围内调节，平行于光片方向的分辨率可以在0.8～4μm范围内调节，接收物镜的倍率越高，波长越短，分辨率越高。
可选地，所述接收物镜与所述套筒透镜之间的距离等于所述套筒透镜的瞳距，所述套筒透镜与所述相机之间的距离等于所述套筒透镜的工作距离；其中，所述套筒透镜的工作距离60～180mm之间，波长范围在400～2000nm之间，瞳距范围在0～170mm之间，厚度范围在25～210mm之间。
具体地，滤光片为长波通滤光片，直径为25mm，截止波长为1000nm、1100nm、1200nm、1300nm、1400nm及1500nm。
可选地，所述相机为InGaAs相机，感光芯片为InGaAs阵列，分辨率为320*256或640*512，像元尺寸为10μm、15μm或20μm，帧速率大于或等于50Hz，响应波长范围在900～1700nm之间，暗电流小于或等于150e-，读出噪声小于或等于50e-。
实施本发明实施例包括以下有益效果：本发明实施例通过激发光源系统产生激发光束，通过空间滤波系统对激发光束进行过滤，通过定向扩束系统对滤波后的激光光束进行扩展，通过多面体转镜改变激光光束的入射角度，从而实现在样品和物镜都不移动的条件下，对样品进行快速三维断层扫描成像；另外，激发物镜和接收物镜与竖直方向夹角均为45°且两者相互垂直，从而实现对正置的样品进行断层扫描。
需要说明的是，本发明实施例可用于离体的组织、器官或活体小动物的深度光学成像，包括但不限于来源于实验动物的未经处理的离体肿瘤组织、脑组织或心肌组织等，来源于小动物的离体心脏或大脑等，来源于小动物的经过组织透明化处理的离体大脑等，来源于活体小动物的肿瘤组织、心脏或大脑等。本发明实施例可以对进行近红外荧光标记的上述样品进行近红外荧光成像，也可以利用水在近红外波段的吸收对活体样品中的血管进行近红外成像。在微米级分辨率下的成像深度可达到2mm，单次扫描体积可达1mm3。
下面以两个具体实施例说明采用本申请的近红外光片显微镜对活体样品进行成像。
实施例一
将[email protected]量子点分散于PBS缓冲液中得到OD808＝4的分散系0.2mL，通过尾静脉注入4周龄的C57小鼠体内，剃掉小鼠头部的毛发，在小鼠头顶放置盖玻片和三棱镜，这三者之间的空隙用80％甘油溶液填充以提高折射率匹配。将小鼠麻醉后放置在激发物镜和接收物镜下，透过皮肤和颅骨对小鼠颅内的血管进行成像。使用的激发波长为808nm，接收滤光片为1500nm，即接收波长长于1500nm的荧光信号，激发物镜为5X，接收物镜为10X，曝光时间为5ms，此时光片厚度为11.9μm，长度为522.3μm，有效数值孔径为0.051。如图2所示，在微米级分辨率下，成像可以穿透皮肤和颅骨，并深入小鼠大脑0.7mm，且成像质量很高，可以清楚的观察到大脑内毛细血管的分布，信噪比在10以上。
实施例二
将IRFEP-Hoechst探针(细胞核靶向)溶于PBS缓冲液中得到OD808＝20的分散系0.02mL，通过脑立体定位注入4周龄的C57小鼠颅内，剃掉小鼠头部的毛发，在小鼠头顶放置盖玻片和三棱镜，这三者之间的空隙用80％甘油溶液填充以提高折射率匹配。将小鼠麻醉后放置在激发物镜和接收物镜下，透过皮肤和颅骨对小鼠大脑进行成像。使用的激发波长为808nm，接收滤光片为1000nm，即接收波长长于1000nm的荧光信号，激发物镜为5X，接收物镜为10X，曝光时间为5ms，此时光片厚度为11.9μm，长度为522.3μm，有效数值孔径为0.051。如图3所示，在微米级分辨率下，成像可以穿透皮肤和颅骨，并深入小鼠大脑0.36mm，信噪比在3以上。
以上是对本发明的较佳实施进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做作出种种的等同变形或替换，这些等同的变形或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
