具体实施方式

本发明的目的是提供一种改造后的新冠病毒SARS-CoV-2S基因及其构建的重组质粒和重组卡介苗及应用，通过以下技术方案实现：

一种改造后的新冠病毒SARS-CoV-2S基因，对新冠病毒SARS-CoV-2S蛋白基因的启动子区域部分序列和终止子区域部分序列进行改造，使其能在穿梭质粒中表达；其碱基序列为SEQ ID NO：1。

本发明还包括一种表达新冠病毒SARS-CoV-2S基因的重组质粒pMVS，将改造后的新冠病毒SARS-CoV-2S基因的碱基序列和大肠杆菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261分别均用BamHⅠ和HindⅢ酶切，酶切位点以T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒pMVS；其中改造后的新冠病毒SARS-CoV-2S基因的碱基序列为SEQ ID NO：1。

本发明还包括一种重组卡介苗rBCG，将上述重组质粒pMVS通过电转化导入BCG感受态细胞，得到重组卡介苗rBCG。

本发明还包括表达新冠病毒SARS-CoV-2S基因的重组质粒pMVS的应用，将表达新冠病毒SARS-CoV-2S基因的重组质粒pMVS导入与现有的疫苗中，得到重组疫苗，重组疫苗在不影响原有疫苗用途的前提下，还能预防或/和治疗新冠病毒；其中可以导入的现有疫苗为预防伤寒杆菌、鼠疫杆菌或李斯特菌等病菌的疫苗。

本发明还包括上述重组卡介苗rBCG的应用，在制备预防和/或治疗新冠病毒SARS-CoV-2引起的肺炎药物制剂中的应用，同时不影响其预防和治疗结核病的用途；该疫苗尤其适用于18岁以下青少年，特别是6岁以下儿童，具有较高的安全性和有效性。

以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。

反转录所用试剂“5X Prime Script IV cDNA Synthesis Mix”、“Random 6mers”，扩增体系试剂“Prime STAR GXL DNA Polymerase”、“PrimeSTAR GXL Buffer”、“dNTPMixture”的生产厂家均为Takara；

S-BCD nionolonal antibody和GoatAnti-Human IgG(H+L)的生产厂家均为Bioworld Technology，Inc，USA；

Middlebrook 7H9液体培养基购自美国BD公司；

本发明实施例采用的质粒pMV261购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心，但不限于只在本单位购买。

SARS-CoV-2病毒的RNA基因组来源于济宁医学院附属医院检验科惠赠，或购买市场上现有的SARS-CoV-2病毒的S基因，如汉恒生物科技(上海)有限公司。

实施例

本发明中，SARS-CoV-2病毒疫苗研制的主要目的是唤起人体免疫反应，诱导抗体产生来阻止病毒的侵入，考虑到稳定性和易传递性等特点，预构建的重组卡介苗(rBCG)为亚单位疫苗，而rBCG比亲代BCG更具有保护效果，故本实验将采取将改造后的SARS-CoV-2S基因与BCG穿梭表达载体pMV261相连的方式，并通过电转化将重组质粒导入BCG感受态细胞，以成功表达S蛋白，对研发SARS-CoV-2重组疫苗，尤其是适合青少年的安全疫苗具有重大意义。

直接用现有的新型冠状病毒的S基因插入“穿梭表达质粒pMV261”后检测不到S蛋白的表达，因此本技术的难点在于如何将新冠病毒S基因插入穿梭表达质粒中及将含有新冠病毒S基因的穿梭表达质粒在现有疫苗中的顺利表达，表达后要同时实现现有疫苗和新冠病毒引起疾病的预防和治疗功能。

一、改造更利于BCG表达的S基因全序列

1.S基因PCR扩增

1.1引物设计

上游引物(S-F)：CGG GGA TCC ATG TTC GTC TTC CTG GTC CTG；

下游引物(S-R)：GCG AAG CTT TTA GGT GTA ATG CAG CTT CAC；

加粗斜体为酶切位点，分别为限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ。

1.2扩增S基因及产物的纯化回收

反转录：5XPrime Script IV cDNA Synthesis Mix 5μ1，Random 6mers(50μM)3μ1，SARS-CoV-2病毒的RNA基因组：总RNA 1μ1(25μg/μ1)，加无RNase(核糖核酸酶)的ddH₂O至最终体系为20μl；所述反转录的程序为：42℃15min后，80℃、10min使酶失活，放在冰上冷却；

以F引物和R引物进行PCR扩增。

扩增体系如下：引物S-F 0.2μl，引物S-R 0.2μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase1μl，5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μl，dNTP Mixture 4μl，加无菌水补至50μl后充分混匀。反应条件为：预变性98℃、4min；变性98℃、10s，退火60℃、15s，延伸68℃、4min以上共扩增30个循环；再延伸68℃、5min。经1％琼脂糖凝胶电泳分离并进行扩增产物纯化回收，按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收说明书操作。

1.3PCR产物酶切及纯化回收

先将PCR产物S和穿梭表达质粒pMV261各用BamHⅠ酶切，总体系20μl，体系如下：S和pMV261各10μl，BamHⅠ1μl，10×Kbuffer 2μl，加无菌水补充至20μl，30℃，过夜孵育。所得的酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离并回收，按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收说明书操作。将上述S和pMV261 BamHⅠ纯化回收产物各用HindⅢ酶切，总体系20μl，体系如下：S和pMV261 BamHⅠ酶切产物各10μl，HindⅢ1μl，10×Kbuffer 2μl，加无菌水补充至20μl，37℃，过夜孵育。所得的酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离并回收，按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收说明书操作。

二、.构建重组质粒并筛选鉴定

将回收产物S和穿梭表达质粒pMV261以T4 DNA连接酶连接，连接体系为：S34μl，pMV2616μl，T4 DNA连接酶5μl，T4 Buffer(10×)5μl，16℃，过夜，将连接产物转入到感受态DH5α中，转化方法：感受态细胞E.coli.DH5α置于冰上融化后取40μl与10μl S蛋白质粒混匀，冰浴30min，42℃热激90s，立即冰浴10min，加入800μl不含抗生素的LB液体培养基，充分混匀，置于37℃、160r/min的摇床中1h，5000r/min离心3min，吸去上清液700μl，将剩余菌液吹打悬浮，接种于LB固体培养基[含卡那霉素(50μg/ml)]，挑取单菌落并接入LB液体培养基[含卡那霉素(50μg/ml)]，37℃、160r/min过夜培养，使用离心柱型质粒小提试剂盒按说明书提取质粒后进行PCR鉴定和测序鉴定。将鉴定正确的重组SARS-CoV-2S质粒命名为pMVS。

三、构建重组卡介苗(rBCG)

3.1 BCG感受态细胞的制备

将Middlebrook 7H9液体培养基在110℃高压蒸汽灭菌15分钟，挑取BCG单菌落接种至含卡那霉素(50μg/mL)的Middlebrook 7H9液体培养基进行液体培养，得到含有BCG的Middlebrook 7H9液体培养基，经37℃、100r/min培养至对数生长期(OD600/A600值为0.60)，冰浴1.5h后4℃、5000r/min离心10min，加入培养液体积1/10的10％预冷甘油后重悬，4℃5000r/min离心10min，再用10％甘油悬浮沉淀。重复洗涤3次，即为BCG感受态细胞。

3.2 BCG的电转化

将BCG感受态细胞冰上融化，取10ul pMVS加入BCG感受态细胞(约9×10⁶个/mL)中充分混匀，冰浴15min，将其移到0.2cm预冷的电转杯中进行电转。电转参数为：电压：2.5kv，电转时间：5.3ms。电转后迅速加入1ml日水生物苏通液体培养基，缓慢地重悬细胞，并将其移至EP管中37℃、100r/min过夜培养。次日将其5000rpm离心10min，将沉淀接种至含50ng/ml卡那霉素的Middlebrook 7H10固体培养基中，37℃、100r/min摇床培养，至长出菜花样菌落，挑取单菌落进行液体培养。

四、数据验证

4.rBCG的诱导表达及S蛋白的提取

用分光光度计测细菌OD595值，当其达0.65时，为对数生长期，将培养至对数生长期的rBCG连续三天45℃诱导45分钟后4000rpm离心15分钟收集菌体，用PBS洗2次后加入裂解液(RIPA：PMSF＝1：100)，冰浴1.5h后进行超声破碎，完成之后4℃离心取上清进行SDS-PAGE电泳；

5.S蛋白功能验证

5.1 S蛋白的Western blot分析

将培养的重组BCG和BCG超声破碎后进行SDS-PAGE电泳，通过湿转法将凝胶中的条带转移至PVDF膜上，经过封闭、S-BCD nionolonal antibody(1)和HRP Goat Anti-HumanIgG(H+L)孵育，进行Western blot分析。

其中湿转法将凝胶中的条带转移至PVDF膜上，经过封闭、S-BCD nionolonalantibody(1)和HRP Goat Anti-Human IgG(H+L)孵育的具体操作为：

SDS-PAGE电泳结束后，剥离凝胶，将PVDF膜浸在甲醇中5分钟，充分激活；随后将PVDF膜和滤纸、海绵、吸管，玻璃棒等浸在配制好的转膜液中2小时；4℃冷柜中150V转膜1.5小时；转膜结束后，将膜取出，放入5％脱脂牛奶中室温震荡封闭1小时；TBST洗3此，每次10分钟；一抗S-BCD nionolonal antibody用5％BSA稀释(1：1000)，将膜放入盛有抗体的离心管中，4℃摇床孵育过夜；TBST洗3次，每次10分钟；辣根过氧化物酶标记的Goat Anti-HumanIgG(H+L)二抗用5％BSA稀释(1：5000)，室温摇床震荡1小时；TBST洗3次，每次10分钟；配ECL工作液，暗室内加X光片曝光，观察结果；

6.PCR扩增S基因

PCR扩增SARS-CoV-2S基因(3822bp)。后经1％琼脂糖凝胶电泳分析，该扩增产物约为3800bp，如图1所示，其大小与预期结果相符。

7.酶切与连接

将PCR产物S基因与BCG穿梭表达质粒pMV261分别用BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切，得到大小分别为3.8kb和4.5kb的酶切片段，如图2所示，与预期结果相符。

8.构建并鉴定重组质粒

以S-pMVS为模板，以上游引物(S-F)和下游引物(S-R)为引物，对目的基因进行扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR后的产物大小约为3800bp，如图3所示，与理论基本一致。

9.DNA测序

将PCR鉴定正确的重组质粒送至上海生工测序，测序结果与改造后的SARS-CoV-2S基因序列完全一致，如图4所示，说明要表达的目的基因已全部正确插入。

10.S基因的诱导表达

重组BCG经热诱导后进行破壁处理提取S蛋白，取适量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电转后进行Westernblot检测。如图5所示，结果显示转重组质粒BCG中S蛋白表达阳性，卡介苗对照组中没有条带，可以看出S蛋白在转重组质粒BCG中融合成功。

11.齐-尼抗酸染色

用接种环分别取适量对数生长期的rBCG(含Kan+(50μg/mL)的Middlebrook 7H9液体培养基均匀地涂抹于洁净的载玻片上，并快速通过酒精灯火焰，固定细菌；滴加石碳酸复红溶液，加热至载玻片开始冒出蒸汽时离开火焰，蒸气消失再加热，如此反复，持续5min，待载玻片冷却后，流水冲洗载玻片，滴加3％盐酸-酒精脱色1min，水洗；滴加0.3％碱性美兰染色30s，水洗；载玻片干燥后，中性树胶封片，10×100倍油镜观察细菌形态，并拍照记录，结果如图6所示，说明培养的是重组成功的BCG。

12.ELISA法测动物血清抗体的效价

将成功构建的重组BCG分别皮下注射6周龄C57BL/6小鼠，注射剂量为100μL/只，采用ELISA法检测其特异性抗体，以PBS以及空载体为对照，每组5只，测定重组BCG免疫小鼠后血清中的抗体的变化，每隔10天免疫1次，共免疫3次。设PBS对照组；空载体对照组；重组腺BCG。在第一次注射前、第二、三次注射前一天及第三次注射后每10天从小鼠尾部取血，到免疫后第15周止；分离血清，用ELISA方法检测血清中的特异性抗体。

在96孔板中，每孔加入的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH值9.0)，新冠病毒S蛋白溶液0.25mL(1μg/mL)，包被24小时过夜(4℃)，次日弃去孔内溶液，用PBS缓冲液洗涤3次后，再加入新鲜稀释的酶标抗体用0.25mL，37℃孵育1小时，用PBS缓冲液彻底洗涤3次后，加入底物TMB溶液0.15mL37℃孵育0.5小时，加入浓度为1.85mol/L的硫酸溶液0.06mL终止其反应。

实验组小鼠血清中的新冠病毒SARS-CoV-2的S蛋白抗体效价平均为：14.432；BCG对照组血清中的新冠病毒SARS-CoV-2的S蛋白抗体效价平均为3.056；PBS对照组血清中的新冠病毒SARS-CoV-2的S蛋白抗体效价平均为1.553。

13.采用双抗体夹心ELISA方法对首次免疫后第1、3、5周血清样本中的IL-4、IFN-γ细胞因子水平进行检测，实验过程如下：

将成功构建的重组BCG分别皮下注射6周龄C57BL/6小鼠，注射剂量为100μL/只，对注射后第1、3、5周血清样本中的IL-4、IFN-γ细胞因子水平进行检测，采用双抗体夹心ELISA法检测其特异性抗体，以PBS以及BCG组为对照，每组5只，具体方法按照eBioscience公司的ELISA试剂盒说明操作：

1)在96孔板中每孔加入100μL Coating Buffer包被缓冲液稀释的Captureantibody(用1×Coating buffer包被缓冲液进行200倍稀释)，4℃条件下避光孵育过夜；

2)弃干净孔中原液，每孔中加入250μL的Wash Buffer，洗涤三次；

3)每孔加入200μL 1×ELISA/ELISAPOT Diluent(稀释液)，室温下静置1h进行封闭；

4)在样品封闭期间准备检测的标准品，按照说明书要求的指示剂量加入dd H₂O，室温下作用30min后，涡旋震荡器震荡后浓度记作500pg/mL；

5)每孔加入250μL的Wash Buffer进行洗涤一次；

6)标准品对照组：1-8孔，从上至下依次加入0、100、100、100、100、100、100、100μL的Diluent，0处(加200μL标准品原液)，吸取100μL后依次进行2倍梯度稀释；

7)其余各孔加血清50μL/孔，加50μL的Diluent，然后混匀，留出一空白孔，只加100μL的Diluent，4℃下孵育8小时；

8)洗涤3-5次；

9)孵育期间准备一抗：DetectionAntibody，使用Diluent进行250倍稀释，每孔加100μL，室温下作用1h；

10)洗涤3-5次；

11)孵育期间准备Avidin-HRP(二抗用Diluent稀释250倍)，每孔加入100μL，封好，室温下作用30min；

12)洗涤6次；

13)每孔加100μL的1×TMB显色剂进行显色，室温作用15分钟；

14)每孔加入50μL终止液；

15)酶标仪中设定570nm进行读数测定。

结果如图8～图9所示(两图中ns>0.1；*P<0.05；**P<0.01)，随着免疫时间的延长，BCG组、重组BCG组IFN-γ、IL-4细胞因子水平逐渐升高，由于IFN-γ参与机体的细胞免疫应答，为Th1类细胞因子的代表，IL-4能够刺激B细胞的增殖，参与体液免疫应答，产生免疫球蛋白，为Th2类细胞因子的代表，可以得出，本发明的重组BCG疫苗可诱导机体产生Th1类与Th2类细胞因子，进而产生均衡的Th1类细胞免疫应答与Th2类体液免疫应答。

14.小鼠淋巴细胞增殖检测

将成功构建的重组BCG分别皮下注射6周龄C57BL/6小鼠，注射剂量为100μL/只，对注射后第6周的小鼠，分离脾淋巴细胞，每组取3只小鼠。具体操作方法如下：

1)准备6孔细胞培养板，第一行中每孔加3mL PBS。第二行中每孔加3mL无血清无抗生素的RPMI-1640培养基，孔板上标记好待检样本编号。同时，准备15mL离心管，同种样本准备3管，其中1管加入5mL脾淋巴细胞分离液，2管备用，均做好标记；

2)将小鼠处死后喷洒75％酒精消毒，在洁净环境下分离脾脏，将脾脏浸入PBS中；

3)将脾脏从PBS中取出，放入研磨网(200目)，用2mL医用注射器柄底部在RPMI-1640培养基孔中研磨脾脏，使其完全破碎；

4)移液器吸取脾细胞研磨好的悬液，再次经滤网(200目)过滤，过滤至50mL离心管中，1500rpm离心10min；

5)弃上清，用5mL RPMI-1640培养基重悬脾细胞沉淀，沿管壁滴入到含6mL脾淋巴细胞分离液的15mL离心管中，1500rpm离心30min；

6)离心后可见为淋巴细胞分离层(白色圆环层)，吸出白色圆环层转移至新的15mL离心管中，补加RPMI-1640培养基至10mL，1500rpm离心10min；

7)弃上清，加入4mL红细胞裂解液，重悬并轻轻震荡混匀后，1500rpm离心10min；

8)弃上清，用1mL RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀后转移到1.5mLEP离心管中；

9)另取EP管，用PBS将细胞稀释20倍，进行细胞计数；

10)选择3×10⁶个细胞进行流式分析，加入到1.5mL EP离心管中，准备2份；3000rpm离心10min，弃上清；

11)期间配制抗体，每个样本用100μLPBS重悬，APC anti-mouse CD3 Antibody(1μL/test)、FITC anti-mouse CD4 Antibody(1μL/test)、PE anti-mouse CD8a Antibody(1μL/test)，4℃孵育30min，设置1组双阴性对照组和3组单染对照组；

12)染色完成后，3000rpm离心10min，弃上清后，然后加入1mL PBS重悬，洗涤两次，3000rpm离心5min；

13)1mL PBS重悬后，进行流式细胞仪检测。

CD3是成熟T淋巴细胞表面的分子标记，CD8+T细胞主要功能是直接特异性杀伤靶细胞，CD4+T细胞的主要功能是增强B细胞介导的体液免疫应答，进而产生抗体及增强吞噬细胞介导的抗感染能力；实验结果如图10所示，(图中ns>0.1；*P<0.05)，可以看出重组BCG疫苗作为免疫原能诱导机体产生CD4+T和CD8+T细胞免疫应答，并且免疫应答的效果要比BCG疫苗优异。

序列表

<110> 济宁医学院

<120> 一种改造后的新冠病毒S 基因及其构建的重组质粒和重组卡介苗及应用

<141> 2021-07-16

<150> 2021104833885

<151> 2021-04-30

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6882

<212> DNA

<213> 新型冠状病毒(SARS-COV-2)

<400> 1

atgttcgtct tcctggtcct gctgcctctg gtctcctcac agtgcgtcaa tctgacaact 60

cggactcagc tgccacctgc ttatactaat agcttcacca gaggcgtgta ctatcctgac 120

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ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 3840

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 3900

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tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 4020

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 4080

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 4140

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 4200

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 4260

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 4320

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 4380

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 4440

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 4500

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 4560

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 4620

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 4680

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 4740

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 4800

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 4860

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 4920

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 4980

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 5040

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 5100

cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 5160

gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 5220

agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 5280

tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 5340

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ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 5580

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ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 5700

acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 5760

caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 5820

aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 5880

acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 5940

acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 6000

ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 6060

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tctgaacctg tgctgaaggg cgtgaagctg cattacacct aa 6882