氯霉素的新型ykkD抗性基因及其应用
技术领域
本发明涉及生物
技术领域
，尤其涉及氯霉素的抗性基因及其应用。背景技术
氯霉素类抗生素是从链霉菌中分离提取的广谱抗生素，对许多革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌等都具有良好的抑制作用。其作用机制主要是通过与核糖体的50S亚基结合，阻断转肽酰酶的作用，进而影响肽链的延伸，抑制蛋白质形成。
基于概率的隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model，HMM)能从可观察的参数中确定该过程的隐含参数，在研究抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)领域中，常被用于补充基因注释以及基因预测，具有开发潜在新型基因的潜力。传统的基因注释常借助于序列相似度的阈值设置，但该方法限制了新型基因的发现，而且对ARGs的注释也有一定的局限性。国内外应用广泛的、基于HMM模型的数据库有Pfam,TIGERFAM,Resfam等，对全面分析和挖掘ARGs起到了至关重要的作用。
ARGs-OAP是一个在线ARGs分析平台，可实现宏基因组数据的ARGs快速注释和定量，其内含的数据库(Structured Antibiotic Resistance genes,SARG)整合了两大ARGs数据库，ARDB和CARD，并通过对ARGs序列的逐级分类注释，为全面分析ARGs奠定了坚实的基础。在SARG数据库基础上，该平台应用HMM模型构建的方法，建立了基于模型比对的数据库SARGfam，可用于开发潜在的新型抗性基因。
发明内容
针对上述背景技术，本发明目的是提供氯霉素的抗性基因及其应用。本发明是从一株Caballeronia(无对应中文名称)中发现了氯霉素的新型抗性基因ykkD_like基因，补充了氯霉素耐药的数据库，为深入研究细菌耐药打下了坚实基础。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明第一方面是提供氯霉素的抗性基因，其基因序列如SEQ ID No.1所示，命名为ykkD_like基因。
本发明第二方面是提供ykkD_like基因表达抑制剂在制备降低受试者对氯霉素耐药性的产品中的应用。
本发明第三方面是检测SEQ ID No.1序列的试剂在制备检测氯霉素耐药性的试剂盒中的应用，进一步地，所述检测SEQ ID No.1序列的试剂为以PCR方法对SEQ ID No.1序列进行定性或定量检测构建的试剂。
本发明第四方面是提供ykkD_like基因作为靶基因在提高受试者对氯霉素敏感度方面的应用。
本发明第五方面是提供ykkD_like基因在制备评估氯霉素耐药性的药盒中的应用。
本发明第六方面是提供一种检测氯霉素耐药性的方法，进一步地，基于SEQ IDNo.1序列信息检测氯霉素耐药性，所述方法不以诊断为目的。
在本发明的技术方案中，所述氯霉素耐药性是指革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌对氯霉素的耐药性。
上述技术方案具有如下优点或者有益效果：
本发明提供氯霉素的的新型抗性基因ykkD_like基因及其应用，其中ykkD_like基因序列如SEQ ID No.1所示。经序列相似度比对，没有在基因组上发现目前已知的抗性基因。本发明对了解氯霉素的耐药机制和补充耐药数据库提供了帮助，也为之后对抗氯霉素耐药提供了理论支持，为解决氯霉素耐药提供靶点，为对抗细菌耐药研究奠定基础。
附图说明
图1是是实施例1中ykkD_like基因与已知参考基因序列之间系统发育树图，用于描述ykkD_like基因序列与已知参考序列之间的差异度。
具体实施方式
下述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。因此，以下提供的本发明实施例中的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1：
1.基因组开放阅读框(open reading frame，ORF)预测
应用prodigal软件对分装得到的纯菌基因组进行ORF预测，得到该基因组的ORF文件。
2.基于HMM模型比对
应用HMMER软件中的hmmscan功能，将步骤1得到的ORF文件与SARGfam数据库进行比对(参数设置：--cut_ga-tblout)，得到基于模型比对的ORF注释结果。其中比对结果如表1所示。
表1
Target name
Query id
E-value
sore
Bias
ykkD_train_msa
CL5.1_1_482
1.3e-19
64.0
4.3
3.基于序列相似度比对
应用blastp，将步骤1得到的ORF文件与SARG数据库进行比对(参数设置：-evalue1e-10-max_target_seqs 1)，得到基于序列相似度的ORF注释结果。其中比对结果如表2所示。
表2
Query id
identity
coverage
Annotation
CL5.1_1_482
39.60
0.96
ykkD
4.潜在新型抗性基因的确定
将步骤3的结果中序列相似度高于70％，覆盖度高于65％的ORF注释结果定义为真，即为已知的ARGs，而不满足该阈值的ORF若在步骤2中存在注释结果，则将该ORF定义为潜在的新型基因；若某一ORF基于序列相似度比对后，不被注释为ARG，但在HMM模型的比对结果中，被注释为ARG，该ORF同样认为是潜在的新型基因。经过筛选，发现该纯菌基因组中存在潜在的新型氯霉素抗性基因要ykkD_like。将SARG数据库中ykkD基因对应的参考序列与ykkD_like的基因序列利用ClustalW进行多重序列比对，并用MEGA构建最大似然系统发育树，通过自举法重抽样1000次评估树的拓扑结构，进一步确定潜在新型基因ykkD_like与已知参考基因序列之间的差异度(如图1)，由图可见，ykkD_like基因序列为单独的分支，与数据库中ykkD的参考序列之间存在明显差异。
实施例2
将含有ykkD_like基因的菌株进行纯化分离，检测其对氯霉素的最小抑菌浓度MIC值之后发现，该菌株对氯霉素的MIC值高达120mg/L，说明ykkD_like基因使得菌株对氯霉素具有抗性，ykkD_like是氯霉素的耐药基因。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 清华大学深圳国际研究生院
<120> 氯霉素的新型ykkD抗性基因及其应用
<130> CP121010590C
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 312
<212> DNA
<213> Caballeronia
<400> 1
atggcatggg tactacttag cctggcaggc gtgcttgaga tcgctttcgc ctttgcgatg 60
aaggcctcag acggcttcac gcgactgacg cccgggctgc ttacggtcgc gagcggactg 120
tcgagcgtga ttctgctctc cgtggcgctc cggacagtgc cggtcgggac cggctacgcc 180
gtgtggactg gaatcggggc ggcgggtacg gcaattcttg gtatcgcttt gctcggagat 240
tcggccgcac cattgcgggt gtttttcatc ctgctgattc tcggtggcgt gatcggactc 300
aagttcgcat ag 312
