一种使用mof材料富集体液中循环游离核酸的方法及其应用
技术领域
本发明涉及体液中循环游离核酸分离富集
技术领域
，具体涉及一种使用MOF材料富集体液中循环游离核酸的方法及其应用。背景技术
全世界人类癌症的发病率和死亡率很大程度上是由于在疾病晚期诊断出来后的治疗干预效果差造成的。现阶段，临床证明的可广泛用于诊断和治疗患者的生物标记物并不不多。最近对血液中循环游离DNA(cell-free DNA,简称cfDNA)的分析表明，对cfDNA的检测分析可能为早期诊断提供新的机会。在健康个体中，血浆中cfDNA的浓度往往在1到10ng/mL之间。1977年首次在癌症患者的血清中报告cfDNA水平升高；cfDNA浓度也可在其他生理条件或临床情况下升高，如急性创伤、脑梗死、运动、移植和感染。1997年，Lo等人对母体血浆中胎儿DNA序列的鉴定，开创了cfDNA在产前医学中的多种应用，包括性别测定、单基因疾病的鉴定和无创性产前检查(NIPT，包括唐氏综合征)。2007年，Lo等人首次展示了NIPT，并且迅速进入广泛的临床应用。血液中的cfDNA的含量非常少，但是对于疾病的诊断和产前诊断是重要的诊断标记物。但是对血液中循环的游离RNA(cfRNA)的研究刚刚起步，cfRNA是否具有成为生物标志物去判断疾病和生理状态还有待更加进一步的确定。1ml血清或血浆中cctDNA和ccRNA的含量大致如下：健康人的血液中的cfDNA约5ng/mL；在癌症患者的血液中最高可达50ng/mL。健康人的血液中的cfRNA大约在5-10ng/mL，癌症患者的比例更高[数据来源Qiagen公司QIAamp ccfDNA/RNA试剂盒的说明书]。因此，高效的富集血液中的cfDNA在对于cfDNA应用能否更多的普及和推进具有决定性的作用；高效的富集血液中的cfRNA对于确定cfRNA的功能以及应用研究都具有深远的意义。
金属-有机框架材料(Metal-organic Framework，MOF，又称金属有机骨架材料，金属有机配合物或配位聚合物)是由无机金属离子或金属簇与有机配体连接而成的晶态多孔材料，兼具有机材料和无机材料共同的特性。MOF的巨大比表面积和丰富的结构多样性使其在客体分子负载，特别是生物分子的负载和释放方面具有重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种使用MOF材料富集体液中循环游离核酸的方法，富集效率高，成本低，使用范围广，兼容度高。
本发明的目的之二在于提供一种使用MOF材料富集体液中循环游离核酸的方法的应用。
本发明实现目的之一所采用的方案是：一种使用MOF材料富集体液中循环游离核酸的方法，包括以下步骤：
(1)处理体液样品，使得体液样品中与蛋白结合的循环游离核酸从蛋白-核酸复合体中释放出来；
(2)将MOF材料加入到步骤(1)中处理后的溶液中，吸附其中循环游离的核酸；
(3)将步骤(2)中吸附了循环游离的核酸的MOF材料分离；
(4)使用EDTA破坏步骤(3)中吸附了循环游离的核酸的MOF材料，释放出吸附的核酸；
(5)对步骤(4)中释放出的核酸进行纯化，得到循环游离DNA和循环游离RNA。
优选地，所述步骤(1)中，在体液中加入硫氰酸胍和聚乙二醇辛基苯基醚使得蛋白质变性，再加入ZnCl2使得蛋白质沉淀出来，将蛋白和上层清液分离，循环游离核酸存在于上层清液中。更为优选地，体液中入硫氰酸胍、聚乙二醇辛基苯基醚和ZnCl2的终浓度分别为0.2-1M、20-200mM和100-400mM。
优选地，所述步骤(1)中，MOF材料为Co-IRMOF-74-III、Co-IRMOF-74-IV、Co-IRMOF-74-V、Ni-IRMOF-74-III、Ni-IRMOF-74-IV、Ni-IRMOF-74-V中的至少一种。
优选地，所述步骤(1)中，体液样品为全血、血浆、血清、尿液、唾液、胸腔积液、脑脊液、淋巴液、腹水中的任意一种。
优选地，所述步骤(2)中，MOF材料的加入量为200-500μg/mL。
优选地，所述步骤(2)中，在吸附反应体系中加入一价、二价金属阳离子；更为优选地，在吸附反应体系中加入一价、二价金属阳离子可以提高提取效率，例如K+，Na+，Mg2+等。
优选地，所述步骤(4)中，在分离出的MOF材料中加入EDTA水溶液至EDTA终浓度为1-10mM，反复吹打或者震荡至出现白色MOF白色有机配体不溶物，将核酸从MOF材料中释放出来。
优选地，所述步骤(5)中，采用冰乙醇沉淀法或者核酸纯化试剂盒对释放出的核酸进行纯化；冰乙醇沉淀法的具体操作为：向步骤(4)得到的核酸溶液中加入无水乙醇溶液，并放置在(-20)-(-70)℃温度下，使核酸固体从溶液中析出，通过低温离心分离得到析出的核酸固体；核酸纯化试剂盒的具体操作为：向步骤(4)得到的核酸溶液中加入乙醇，吸附到纯化柱中的玻璃纤维材料上，然后用水将核酸从纯化柱中洗脱下来，达到纯化核酸的目的。
优选地，还包括步骤(6)：分别用RNA水解酶或者DNA水解酶处理步骤(5)得到循环游离核酸，得到单一的cfDNA或者cfRNA。
本发明富集得到的循环游离核酸包括循环游离DNA(cfDNA)和循环游离RNA(cfRNA)。若需要得到单一的cfDNA，只需要用RNA水解酶处理富集得到的循环游离核酸，将RNA水解只留下cfDNA。若需要得到单一的cfRNA，只需要用DNA水解酶处理富集得到的循环游离核酸，将DNA水解只留下cfDNA。
本发明实现目的之二所采用的方案是：一种所述的使用MOF材料富集体液中循环游离核酸的方法在肿瘤cfDNA富集检测中的应用。
本发明具有以下优点和有益效果：
本发明公开了一种体液中循环游离核酸(cell free nuclei acids)的富集方法，富集、纯化得到的核酸可以进行下游的分析和检测，包括实时荧光定量PCR和二代测序技术定量定性分析循环游离DNA。
本发明的方法创造性的将MOF材料用于体液中循环游离核酸富集，其优点在于：(1)对体液中的循环游离核酸富集效率非常高，因为MOF材料孔隙率高，具有巨大的比表面积，对核酸分子具有高效的吸附作用。(2)富集循环游离核酸的成本低，本发明的方法只需要将材料和体液样品简单的混合即可，不需要负载的装置制备工艺。(3)本发明的富集循环游离核酸的对溶液体积的容忍范围很宽，可以从少量的200uL体液中富集，也可以从几毫升的体液中提取，这主要是本发明的方法和商业化的试剂盒的富集原理不一样。商业化的试剂盒主要是利用核酸在乙醇溶剂中的溶解度降低，沉淀吸附到玻璃纤维柱材料中，然后用水将吸附到柱材料中的核酸洗脱下来，水的洗脱效率较低，如果是少量的核酸吸附到玻璃纤维中的损失非常大。以上三点有点使得本发明的体液循环游离核酸富集方法相比于其他的商业化的富集方法在价格、体液使用量变化范围和吸附效率方面都具有很高的优势。(4)本发明富集得到的循环游离核酸，包括cfDNA和cfRNA，相比较于cfDNA，cfRAN的含量更低，很多富集方法只能得到cfDNA。(5)本发明的方法不仅可以对各种类型的血液(包括全血，血浆和血清)中的循环游离核酸进行分离富集，同样可以适用于其他各种类型的体液中的循环游离核酸的富集，包括但不局限于尿液、唾液、胸腔积液、脑脊液、淋巴液、腹水等。
附图说明
图1为本发明的方法的流程示意图；
图2 Qubit荧光仪定量检测MOF方法和试剂盒方法富集得到的cfDNA的含量；
图3实时荧光定量PCR对比MOF方法和试剂盒方法富集得到的cfDNA的含量；
图4二代测序技术对比MOF方法和试剂盒方法富集得到的cfDNA的成分差别。
具体实施方式
为更好的理解本发明，下面的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
本例为了阐明本发明陈述的富集方法的效率以及优越性，将本发明的富集方法与商业化试剂盒(QIAamp ccfDNA/RNA kit)富集得到的cfDNA进行比较。
本发明实施例采用Co-IRMOF-74-III，Co-IRMOF-74-IV和Co-IRMOF-74-V这三种材料作为富集材料，使用血浆作为研究样本，为了准确对比MOF富集方法和试剂盒富集方法得到的cfDNA之间的差异，我们将几个人的血浆样本进行混合后用于后续的实验。
实施例1：MOF材料和试剂盒的方法分别富集血浆中cfDNA
本实施例使用Co-IRMOF-74-III，Co-IRMOF-74-IV和Co-IRMOF-74-V这三种材料分别吸附500μL混合血浆中的cfDNA，图1为本实施例中的方法流程示意图。
1.血浆样本的处理
(1)取500μL血浆样本于1mL EP管中，加入硫氰酸胍(Guanidine thiocyanate)溶液(终浓度为500mM)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)(终浓度为50mM)，涡旋5s，混合均匀以后，在室温放置3min。
(2)加入ZnCl2溶液(终浓度为300mM),立刻涡旋1min，出现乳白色不溶物，在冰上放置3min。
(3)12000g离心3min，可以看见乳白色沉淀，上清液是澄清透亮的淡黄色液体，将上清转移至干净的EP管中备用，500μL血浆大概可以得到500μL上清液。
2.MOF材料吸附血浆中的cfDNA：
吸附过程的反应体系按照下表进行配置：
种类
体积
步骤1得到的上清
500μL
MOF(20mg/mL)
20μL
10×PBS
60μL
10×MgCl<sub>2</sub>(200mM)
60μL
Volume
640μL
以上反应在旋转仪上室温反应2h。
3.反应结束以后，以上反应12000g离心15min，去掉上清液，收集沉淀(沉淀为粉红色的固体)。
4.破坏MOF材料释放cfDNA：沉淀中加入40μL无酶水，再加入10μL EDTA(150mM)溶液，用枪头混合3min(也可以震荡3min)。可以看见粉色固体消失，出现白色絮状不溶物。
5.纯化步骤4得到cfDNA：有两种纯化方式，分别是冰乙醇沉淀的方法和DNA纯化试剂盒方法冰乙醇沉淀方法：
(1)冰乙醇方法：步骤4得到的混合液中加入5μL的乙酸钠(3mol/L，pH＝5.2)，充分混匀，使其最终浓度为0.3mol/L；
(2)加入150μL预冷的冰乙醇混合后再次充分混匀置于-80℃中30分钟到2小时之间；
(3)12000g离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；
(4)加入1/2离心管容量的75％冰乙醇，吹打三次，12000g离心2分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；
(5)于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上5分钟，以使残留的液体挥发至干；
(6)加入20μL无酶水将EP管底的cfDNA固体溶解，放置于-20℃冰箱备用。DNA纯化试剂盒方法(ZYMO RESEARCH公司的DNA纯化试剂盒，DNA Clean&ConcentratorTM-5)：
(1)以上50μL反应液中加入100μL Oligo Binding Buffer,混匀。
(2)加入400μL 100％无水乙醇，混匀后转移至zymo的柱子中(柱子放在收集管中)。
(3)柱子12000g离心1min，丢弃流出来的废液，收集管继续套在柱子上。
(4)在柱子中加入750μL DNA washing buffer，12000g离心1min后丢掉废液，将收集管套回到柱子中，再次12000g离心2min。
(5)将柱子转移至干净的无酶EP管中，柱子中央加入20μL无酶水，室温放置3min后，12000g离心2min。得到纯化的cfDNA放置于-20度冰箱中用于后续实验。
对比例：试剂盒方法提取血浆中的cfDNA
使用Qiagen公司的循环游离核酸富集试剂盒(QIAamp ccfDNA/RNA kit)，血浆样本是前面叙述的混合血浆样本500μL，详细步骤如下按照试剂盒提供的说明书操作，得到的cfDNA保存在-20℃度备用。
实施例2：对比分析MOF材料富集方法和试剂盒方法富集的大的cfDNA的含量和成分
Qubit定量cfDNA：
仪器：Qubit荧光仪(Invitrogen Qubit 4)试剂：Qubit 1x dsDNA HS检测试剂盒。
按照Qubit检测试剂盒的检测说明书和仪器的使用说明，分别检测Co-IRMOF-74-III，Co-IRMOF-74-IV和Co-IRMOF-74-V分离富集cfDNA和试剂盒富集的cfDNA的含量。检测结果如图2，同等量的血浆(500μL使用Co-IRMOF-74-III，Co-IRMOF-74-IV和Co-IRMOF-74-V三种材料的富集得到的cfDNA，Co-IRMOF-74-V得到是的cfDNA的含量最高，得到24.8ngdecfDNA，同等量的血浆，用试剂盒得到的cfDNA的含量为29.8ng。Co-IRMOF-74-V方法提取的cfDNA的量与试剂盒的方法得到的cfDNA的含量接近，说明的本发明的富集方法与商业化试剂盒的方法达到了相同的效果。
qPCR定量对比：使用荧光定量PCR的方法检测Co-IRMOF-74-III，Co-IRMOF-74-IV和Co-IRMOF-74-V分离富集cfDNA和试剂盒富集的cfDNA的含量。选择ALU基因作为检测目标基因，设计qPCR引物如下：5’-CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG-3’和5’-CCCGAGTAGCTGGGATTACA-3’。qPCR的测试结果如图3，Co-IRMOF-74-III，Co-IRMOF-74-IV和Co-IRMOF-74-V样品测试的ct值(Cycle Threshold)依次增高，说明其富集得到cfDNA的量依次增加。Co-IRMOF-74-V和试剂盒得到的cfDNA的ct值比较接近，与Qubit定量方法得到的结果一致。
二代测序技术分析不同方法之间富集得到cfDNA的成分差异：将Co-IRMOF-74-III，Co-IRMOF-74-IV和Co-IRMOF-74-V分离富集cfDNA和试剂盒富集的cfDNA分别进行测序文库的构建，使用试剂盒(NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina)，详细的步骤参考试剂盒说明书的方法。测序得到的数据进行主成分分析，结果如图4所示，Co-IRMOF-74-III，Co-IRMOF-74-IV和Co-IRMOF-74-V和试剂盒富集得到的cfDNA的主成分差异非常小，也就是这四个样本中的cfDNA的成分差异非常小，说明本发明的富集方法富集得到的cfDNA在成分方面几乎是一样的。
以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。
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