胆管癌胆汁外泌体的提取方法
技术领域
本发明属于临床医疗
技术领域
，特别是涉及胆管癌胆汁外泌体的提取方法。背景技术
胆管癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤，目前对其诊断及预后预测尚缺乏有效的生物学标志物。因此，发现新的可靠的胆管癌标志物对于其初筛、早期诊断、复发监测及预后预测都具有十分重要的意义。外泌体是由细胞分泌释放的一种直径30–150nm左右的脂质双层囊泡，内含特异性蛋白和核酸，广泛存在于血液、尿液、胆汁等多种体液中。近年来研究表明，体液中外泌体及其所含的非编码RNA(如microRNA、lncRNA、circRNA等)可以反映肿瘤的进展和预后，可能成为一种新的肿瘤标志物，但是目前对于该方面的研究较少，并不能达到较好的应用。
发明内容
为了克服上述的问题，本发明提供了胆管癌胆汁外泌体的提取方法。
本发明所采用的技术方案是：
胆管癌胆汁外泌体的提取方法，包括如下步骤：
步骤一：标本的采集：步骤1.1：取胆管癌患者胆汁标本10ml-20ml，胆汁标本取自于ERCP或PTCD(均在胆管插入成功后推注造影剂前抽出胆汁)；步骤1.2：胆汁收集后立即置于干燥试管中，避光并置于4℃冰箱中，2h内以4000r/min离心10min后取上清液并置于无RNA酶的离心管中；步骤1.3：术前抽取空腹静脉血5ml-10ml，血液标本室温静置2h，4000r/min离心l0min，取上层血清于无RNA酶的离心管中；步骤1.4：胆汁及血清标本收集好后均放于-80℃冻存备用；
步骤二：外泌体的提取：步骤2.1：离心前一天，胆汁标本从-80度冰箱取出置于4度冰箱融化，得到50ml黄色胆汁；步骤2.2：胆汁以4°、300g、5min离心1次，然后取上清液；步骤2.3：上清以4°、2000g、10min离心1次，然后取上清；步骤2.4：得到的50mL上清液稀释至60mL，以4°、12500g、离心30min，离心结束后取上清液；步骤2.5：得到的胆汁上清液稀释至70mL，过0.22um筛子后，以4°、120000g、离心2h，得到底部沉淀即为外泌体，将该沉淀用无菌D-PBS反复吹打溶解后转移至EP管中，共得到200uL外泌体悬液，NTA检测后置于-80°冰箱中保存；
步骤三：外泌体的鉴定：采用透射电镜观察所提取到胆汁外泌体颗粒形态；采用纳米颗粒跟踪分析技术测定外泌体粒径大小；采用Western blotting检测外泌体表面蛋白标志物的表达情况，其中所使用的抗体包括CD63、TSG101、Hsp70。
本发明的优点如下：
通过标本的采集、外泌体的提取、外泌体的鉴定，进而能够实现对胆管癌胆汁外泌体的提取，在临床诊疗中有巨大的潜在应用价值。
具体实施方式
下面对本发明作进一步的说明，但本发明并不局限于这些内容。
实施例1
胆管癌胆汁外泌体的提取方法，包括如下步骤：
步骤一：标本的采集：步骤1.1：取胆管癌患者胆汁标本10ml，胆汁标本取自于ERCP(均在胆管插入成功后推注造影剂前抽出胆汁)；步骤1.2：胆汁收集后立即置于干燥试管中，避光并置于4℃冰箱中，2h内以4000r/min离心10min后取上清液并置于无RNA酶的离心管中；步骤1.3：术前抽取空腹静脉血5ml，血液标本室温静置2h，4000r/min离心l0min，取上层血清于无RNA酶的离心管中；步骤1.4：胆汁及血清标本收集好后均放于-80℃冻存备用；
步骤二：外泌体的提取：步骤2.1：离心前一天，胆汁标本从-80度冰箱取出置于4度冰箱融化，得到50ml黄色胆汁；步骤2.2：胆汁以4°、300g、5min离心1次，然后取上清液；步骤2.3：上清以4°、2000g、10min离心1次，然后取上清；步骤2.4：得到的50mL上清液稀释至60mL，以4°、12500g、离心30min，离心结束后取上清液；步骤2.5：得到的胆汁上清液稀释至70mL，过0.22um筛子后，以4°、120000g、离心2h，得到底部沉淀即为外泌体，将该沉淀用无菌D-PBS反复吹打溶解后转移至EP管中，共得到200uL外泌体悬液，NTA检测后置于-80°冰箱中保存；
步骤三：外泌体的鉴定：采用透射电镜观察所提取到胆汁外泌体颗粒形态；采用纳米颗粒跟踪分析技术测定外泌体粒径大小；采用Western blotting检测外泌体表面蛋白标志物的表达情况，其中所使用的抗体包括CD63、TSG101、Hsp70。
实施例2
胆管癌胆汁外泌体的提取方法，包括如下步骤：
步骤一：标本的采集：步骤1.1：取胆管癌患者胆汁标本20ml，胆汁标本取自于PTCD(均在胆管插入成功后推注造影剂前抽出胆汁)；步骤1.2：胆汁收集后立即置于干燥试管中，避光并置于4℃冰箱中，2h内以4000r/min离心10min后取上清液并置于无RNA酶的离心管中；步骤1.3：术前抽取空腹静脉血10ml，血液标本室温静置2h，4000r/min离心l0min，取上层血清于无RNA酶的离心管中；步骤1.4：胆汁及血清标本收集好后均放于-80℃冻存备用；
步骤二：外泌体的提取：步骤2.1：离心前一天，胆汁标本从-80度冰箱取出置于4度冰箱融化，得到50ml黄色胆汁；步骤2.2：胆汁以4°、300g、5min离心1次，然后取上清液；步骤2.3：上清以4°、2000g、10min离心1次，然后取上清；步骤2.4：得到的50mL上清液稀释至60mL，以4°、12500g、离心30min，离心结束后取上清液；步骤2.5：得到的胆汁上清液稀释至70mL，过0.22um筛子后，以4°、120000g、离心2h，得到底部沉淀即为外泌体，将该沉淀用无菌D-PBS反复吹打溶解后转移至EP管中，共得到200uL外泌体悬液，NTA检测后置于-80°冰箱中保存；
步骤三：外泌体的鉴定：采用透射电镜观察所提取到胆汁外泌体颗粒形态；采用纳米颗粒跟踪分析技术测定外泌体粒径大小；采用Western blotting检测外泌体表面蛋白标志物的表达情况，其中所使用的抗体包括CD63、TSG101、Hsp70。
实施例3
胆管癌胆汁外泌体的提取方法，包括如下步骤：
步骤一：标本的采集：步骤1.1：取胆管癌患者胆汁标本15ml，胆汁标本取自于ERCP(均在胆管插入成功后推注造影剂前抽出胆汁)；步骤1.2：胆汁收集后立即置于干燥试管中，避光并置于4℃冰箱中，2h内以4000r/min离心10min后取上清液并置于无RNA酶的离心管中；步骤1.3：术前抽取空腹静脉血7ml，血液标本室温静置2h，4000r/min离心l0min，取上层血清于无RNA酶的离心管中；步骤1.4：胆汁及血清标本收集好后均放于-80℃冻存备用；
步骤二：外泌体的提取：步骤2.1：离心前一天，胆汁标本从-80度冰箱取出置于4度冰箱融化，得到50ml黄色胆汁；步骤2.2：胆汁以4°、300g、5min离心1次，然后取上清液；步骤2.3：上清以4°、2000g、10min离心1次，然后取上清；步骤2.4：得到的50mL上清液稀释至60mL，以4°、12500g、离心30min，离心结束后取上清液；步骤2.5：得到的胆汁上清液稀释至70mL，过0.22um筛子后，以4°、120000g、离心2h，得到底部沉淀即为外泌体，将该沉淀用无菌D-PBS反复吹打溶解后转移至EP管中，共得到200uL外泌体悬液，NTA检测后置于-80°冰箱中保存；
步骤三：外泌体的鉴定：采用透射电镜观察所提取到胆汁外泌体颗粒形态；采用纳米颗粒跟踪分析技术测定外泌体粒径大小；采用Western blotting检测外泌体表面蛋白标志物的表达情况，其中所使用的抗体包括CD63、TSG101、Hsp70。
指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
