一种胎盘干细胞的制备培养方法
技术领域
本发明属于干细胞的分离制备
技术领域
，具体是指一种胎盘干细胞的制备培养方法。背景技术
干细胞治疗技术是近年来生命科学领域的新兴技术，已经被应用到了多种难治性疾病的治疗研究中，并取得了积极的进展。目前，全球干细胞治疗市场可分为地中海贫血、脑瘫、糖尿病、白血病、自闭症等等。随着糖尿病等许多疾病发病率的逐年攀升，增加了对干细胞的临床需求，从而推动了干细胞治疗市场的发展。
胎盘是胎儿与母体之间进行物质交换的器官，起源于胚胎发育期胚外中胚层，是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。从胎盘中提取出来的干细胞的细胞形态、增殖能力、表面抗原标志、基因表达等与骨髓间充质干细胞高度相似，而且也具有多向分化的潜能。
胎盘来源干细胞因取自生产后的胎盘组织，其收取过程对母体和新生儿不造成任何损伤，来源不受伦理学和临床医学的限制，是理想的干细胞资源。
发明内容
为了解决上述难题，本发明提供了一种可以提高干细胞的安全性，简化操作步骤的胎盘干细胞的制备培养方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：一种胎盘干细胞的制备培养方法，包括如下步骤：
1)产妇筛查；
2)样本采集；
3)样本运输；
4)样本交接；
5)样本检测；
6)样本预处理；
7)细胞分离制备；
8)原代培养；
9)传代培养；
10)细胞检测；
11)建立可供检索的细胞信息档案；
12)编码并上传细胞信息档案。
进一步地，所述步骤1)中产妇筛查是指在充分了解产妇及其丈夫家族病史及旅居史的情况符合供者条件后，取5ml产妇外周血进行病原微生物检测，包括但不限于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等传染病检测。
进一步地，所述步骤2)中样本采集为将正常足月分娩健康新生儿胎盘进行无菌采集，包括如下步骤：
1)待胎儿娩出断脐后，采集5ml脐血用于病原微生物等检测；
2)胎盘娩出后，用生理盐水冲洗掉胎盘表面的血渍；
3)将胎盘置于装有400-600ml储存液的采集盒中；
进一步地，所述储存液为含40UI/ml庆大霉素的生理盐水。
进一步地，所述步骤3)中样本运输为将采集好胎盘的采集盒转移至4-8℃的疫苗箱中保存，12-48小时内运送至存储地。
进一步地，所述步骤4)中样本交接为待样本运输至存储地后样本接收人员对样本进行检查，观测样本有无异常，登记相关信息并编码。
进一步地，所述步骤5)中样本检测为对胎盘进行无菌检测，包括但不限于支原体、真菌、细菌、微生物等，具体的为打开采集盒抽取储存液和/或取步骤7)中最后一次离心洗上清液进行检测。
进一步地，所述步骤6)中样本预处理包括如下步骤：
1)为样本检测合格后，从采集盒中取出胎盘；
2)用生理盐水中充分洗涤胎盘以洗净残血；
3)用75％医用酒精消毒浸泡；
4)再用生理盐水漂洗2-3次。
进一步地，所述步骤7)中细胞分离制备，包括如下步骤：
1)将预处理后的胎盘转移至工作台内，胎盘胎儿面(光滑面)朝上，以脐带根部为中心划十字切口轻轻剥离羊膜；
2)用眼科弯剪小心分离胎盘小叶，将剥离的胎盘小叶再次用生理盐水清洗干净，沥干水分；
3)用眼科弯剪挑剪组织块，直至组织块呈肉糜状为止，将剪好的组织块转移至50ml离心管内，加入含有5-20倍体积的0.05％-0.25％的酶消化30-120min后，加入5-10倍体积的生理盐水终止消化，吹打混匀，按照1：(1-3)的比例缓慢加入到分装好的淋巴细胞分离液中，离心机升1降1，1000-2000rpm，4℃离心20分钟，取中间白膜层及白膜层上方细胞，再用生理盐水离心洗涤两次去除上清液，离心机升9降9，1000-2500rpm，4℃离心3-10min。
进一步地，所述酶优先选择0.1％胶原酶IV。
进一步地，所述在使用眼科弯剪处理组织块时宜采用弯剪挑起剪10-40min，剪成0.5-1.2mm3大小的组织碎块为宜。
进一步地，所述步骤8)中原代培养，包括如下步骤：
1)将处理好的组织块或细胞用适量间充质干细胞原代培养液重悬后接种至培养皿中，间充质干细胞原代培养液应没过细胞或组织块2-5mm；
2)将接种好组织块或细胞的培养皿放置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔3天观察一次，每隔5-7天根据细胞爬出情况补液或者换液。
进一步地，所述间充质干细胞原代培养液优先选择添加了干细胞培养因子的无血清培养液，为了进一步防止操作不当引起的细胞污染，间充质干细胞原代培养液中需添加庆大霉素(40UI/ml)。
进一步地，所述细胞消化优先选择干细胞温和酶；细胞消化酶用量以覆盖全部细胞为宜；细胞消化时间以细胞全部变圆可以砂状下滑为宜。
进一步地，所述步骤9)中传代培养为待细胞爬出融合度达到25-40％后进行传代，包括如下步骤：
1)去除培养液，加入适量生理盐水清洗1-3次，彻底去除残留的组织块；
2)加入1-5ml干细胞温和酶或胰酶室温消化1-5min后，加入5倍体积生理盐水终止消化；
3)收集细胞悬液1200-1700rpm离心3-15min弃上清液，所得细胞沉淀记为P0代细胞；
4)将P0代细胞接种至含20-25ml无血清完全培养基的150mm培养皿中，放入CO2浓度5％，温度37℃培养箱中培养中继续培养；
5)待细胞增殖融合度达到85-95％后，按照上述处理步骤进行消化收集得到P1代细胞；
6)将收集的P1代细胞接种至含20-25ml无血清完全培养基的150mm培养皿中，放入CO2浓度5％，温度37℃培养箱中继续培养，待细胞增殖融合度达到85-95％后按照上述处理步骤进行消化即得到P2代细胞；
7)重复以上步骤即可得到P3、P4-PN代细胞。
进一步地，所述为了进一步防止操作不当引起的细胞污染，无血清完全培养基需添加庆大霉素(40UI/ml)。
进一步地，所述步骤10)中细胞检测，包括如下步骤：
1)在培养过程中对细胞培养上清进行细菌、内毒素、支原体检测；
2)细胞收获后采用血球计数板对收获的细胞进行计数并利用台盼蓝染色测定细胞活性，同时利用流式细胞仪检测细胞表面标志物。
进一步地，所述步骤11)、步骤12)中建立可供检索的细胞信息档案、编码并上传细胞信息档案，包括如下步骤：
1)按照每人一组系统编号；
2)将相关信息包括样本来源、样本信息、编码、制备培养信息等纸质版归档并统一输入计算机记录。
本发明采取上述结构取得有益效果如下：本发明一种胎盘干细胞的制备培养方法，细胞增殖分化能力强，杂细胞少，相对纯净，分离培养过程简单，工作量小，细胞爬出概率高，能够收获很大数量的间充质干细胞，满足大批量生产干细胞制品及临床应用的需要。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种胎盘干细胞的制备培养方法，包括如下步骤：
1)产妇筛查；
2)样本采集；
3)样本运输；
4)样本交接并编码；
5)样本检测；
6)样本预处理；
7)细胞分离制备；
8)原代培养；
9)传代培养；
10)细胞检测；
11)建立可供检索的细胞信息档案；
12)并上传细胞信息档案。
所述步骤1)中产妇筛查是指在充分了解产妇及其丈夫家族病史及旅居史的情况符合供者条件后，取5ml产妇外周血进行病原微生物检测，包括但不限于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等传染病检测。
所述步骤2)中样本采集为将正常足月分娩健康新生儿胎盘进行无菌采集，包括如下步骤：
1)待胎儿娩出断脐后，采集5ml脐血用于病原微生物等检测；
2)胎盘娩出后，用生理盐水冲洗掉胎盘表面的血渍；
3)将胎盘置于装有400-600ml储存液的采集盒中；
所述步骤3)中样本运输为将采集好胎盘的采集盒转移至4-8℃的疫苗箱中保存，12-48小时内运送至存储地。
所述步骤4)中样本交接为待样本运输至存储地后样本接收人员对样本进行检查，观测样本有无异常，登记相关信息并编码。
所述步骤5)中样本检测为对胎盘进行无菌检测，包括但不限于支原体、真菌、细菌、微生物等，具体的为打开采集盒抽取储存液进行检测。
所述步骤6)中样本预处理包括如下步骤：
1)为样本检测合格后，从采集盒中取出胎盘；
2)用生理盐水中充分洗涤胎盘以洗净残血；
3)用75％医用酒精消毒浸泡；
4)再用生理盐水漂洗2-3次。
所述步骤7)中细胞分离制备，包括如下步骤：
1)将预处理后的胎盘转移至工作台内，胎盘胎儿面，光滑面朝上，以脐带根部为中心划十字切口轻轻剥离羊膜；
2)用眼科弯剪小心分离胎盘小叶，将剥离的胎盘小叶再次用生理盐水清洗干净，沥干水分；
3)用眼科弯剪挑剪组织块，直至组织块呈肉糜状为止，将剪好的组织块转移至50ml离心管内，加入含有5-20倍体积的0.05％-0.25％的酶消化10-120min后，加入5-10倍体积的生理盐水终止消化，吹打混匀，按照1：(1-3)的比例缓慢加入到分装好的淋巴细胞分离液中，离心机升1降1，1000-2000rpm，4℃离心20分钟，取中间白膜层及白膜层上方细胞，再用生理盐水离心洗涤两次，离心机升9降9，1000-2500rpm，4℃离心3-10min。
所述步骤8)中原代培养，包括如下步骤：
1)将处理好的组织块或细胞用适量间充质干细胞原代培养液重悬后接种至培养皿中，间充质干细胞原代培养液应没过细胞或组织块2-5mm；
2)将接种好组织块或细胞的培养皿放置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔3天观察一次，每隔5-7天根据细胞爬出情况补液或者换液。
所述步骤9)中传代培养为待细胞爬出融合度达到25-40％后进行传代，包括如下步骤：
1)去除培养液，加入适量生理盐水清洗1-3次，彻底去除残留的组织块；
2)加入1-5ml干细胞温和酶或胰酶室温消化1-5min后，加入5倍体积生理盐水终止消化；
3)收集细胞悬液1200-1700rpm离心3-15min弃上清液，所得细胞沉淀记为P0代细胞；
4)将P0代细胞接种至含20-25ml无血清完全培养基的150mm培养皿中，放入CO2浓度5％，温度37℃培养箱中培养中继续培养；
5)待细胞增殖融合度达到85-95％后，按照上述处理步骤进行消化收集得到P1代细胞；
6)将收集的P1代细胞接种至含20-25ml无血清完全培养基的150mm培养皿中，放入CO2浓度5％，温度37℃培养箱中继续培养，待细胞增殖融合度达到85-95％后按照上述处理步骤进行消化即得到P2代细胞；
7)重复以上步骤即可得到P3、P4-PN代细胞。
所述步骤10)中细胞检测，包括如下步骤：
1)在培养过程中对细胞培养上清进行细菌、内毒素、支原体检测；
2)细胞收获后采用血球计数板对收获的细胞进行计数并利用台盼蓝染色测定细胞活性，同时利用流式细胞仪检测细胞表面标志物。
所述步骤11)、步骤12)中建立可供检索的细胞信息档案、编码并上传细胞信息档案，包括如下步骤：
1)按照每人一组系统编号；
2)将相关信息包括样本来源、样本信息、编码、制备培养信息等纸质版归档并统一输入计算机记录。
实施例2
一种胎盘干细胞的制备培养方法，由以下步骤组成：产妇筛查、样本采集、样本运输、样本交接、样本检测、样本预处理、细胞分离制备、原代培养、传代培养、细胞检测、建立可供检索的细胞信息档案、编码并上传细胞信息档案，具体包括以下步骤：
1)产妇筛查：首先对产妇及其丈夫的家族病史及旅居史的情况进行调查，符合供者条件后，取5ml产妇外周血进行病原微生物检测，包括但不限于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等传染病检测；
2)样本采集：将正常足月分娩健康新生儿胎盘进行无菌采集，其具体步骤为胎儿娩出断脐后采集5ml脐血进行病原微生物检测，包括但不限于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等传染病检测；胎盘娩出后在距胎盘3-5cm处剪断脐带，将去掉脐带后的胎盘置于装有400-600ml储存液的采集盒中；将采集盒置于4℃条件保存，12小时内运送至公司登记相关信息；
3)样本运输：将采集好胎盘的采集盒转移至4-8℃的疫苗箱中保存，12-48小时内运送至存储地；
4)样本交接：待样本运输至存储地后，样本接收人员对样本进行检查，观测样本有无异常，登记相关信息并编码；
5)样本检测：样本接收人员收到样本后检查样本有无异常，将样本交于微生物实验室进行传染病、无菌检测，样本无异常情况下交接给实验室制备人员处理；
6)样本预处理：样本检测合格后，从采集盒中取出胎盘，用生理盐水中充分洗涤胎盘以洗净残血，用75％医用酒精消毒浸泡，再用生理盐水漂洗2-3次；
7)细胞分离制备：将预处理后的新鲜胎盘胎儿面(光滑面)朝上，以脐带根部为中心划十字切口轻轻剥离羊膜，剥离羊膜后，小心分离胎盘小叶，将剥离的胎盘小叶再次用生理盐水清洗干净，沥干水分，用眼科弯剪剪碎呈肉糜状转移至50ml离心管内，加入含有5倍体积的0.25％的胶原酶消化30min后加入10倍体积的生理盐水终止消化，吹打混匀，按照1：1的比例缓慢加入到分装好的淋巴细胞分离液中，离心机升1降1，2000rpm，4℃离心20分钟，取中间白膜层及白膜层上方细胞，再用生理盐水离心洗涤两次(离心机升9降9，2000rpm，4℃离心5min)；
8)原代培养：加入3倍体积间充质干细胞原代培养液重悬处理好的组织块或细胞后接种至培养皿中，根据培养液覆盖组织或细胞情况决定是否补充培养液，保证间充质干细胞原代培养液应没过细胞或组织块2mm，摇匀后将培养皿转移至37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔3天观察一次，每隔5-7天根据细胞爬出情况补液或者换液；
9)传代培养：待细胞爬出融合度达到25-40％后进行传代，其步骤为：小心去除培养液，加入适量生理盐水清洗2次，以彻底去除残留的组织块，加入3ml干细胞温和酶消化3min后加入5倍体积生理盐水终止消化；收集细胞悬液1200rpm离心10min弃上清液，所得细胞沉淀记为P0代细胞；将P0代细胞接种至含20ml无血清完全培养基的150mm培养皿中，放入CO2浓度5％，温度37℃培养箱中培养中继续培养，待细胞增殖融合度达到85-95％后按照上述处理步骤进行消化收集得到P1代细胞；将收集的P1代细胞接种至含20-25ml无血清完全培养基的150mm培养皿中，放入CO2浓度5％，温度37℃培养箱中培养中继续培养，待细胞增殖融合度达到85-95％后按照上述处理步骤进行消化即得到P2代细胞；重复以上步骤即可得到P3、P4-PN代细胞；
10)细胞检测：细胞检测为在细胞培养过程中对细胞培养上清进行细菌、内毒素、支原体等检测；细胞收获后采用血球计数板对收获的细胞进行计数并利用台盼蓝染色测定细胞活性，同时利用流式细胞仪检测细胞表面标志物；
11)建立可供检索的细胞信息档案并上传细胞信息档案为按照每人一组系统编号，并将相关信息包括样本来源、样本信息、编码、制备培养信息等纸质版归档并统一输入计算机记录，用于管理和检索。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
