一种提高克隆胚胎发育质量的添加剂及其应用
技术领域
本发明涉及体细胞克隆
技术领域
，尤其涉及一种提高克隆胚胎发育质量的添加剂及其应用。背景技术
体细胞核移植(The somatic cell nuclear transfer,SCNT)技术，又称克隆技术，广泛的应用于畜牧生产、基因编辑研究、治疗性克隆等领域。在畜牧生产上，克隆技术已经能够应用于扩繁优良种畜、生产生物反应器以及节粮环保和抗病品种的培育。但是SCNT胚胎的低发育效率一直是限制其扩大应用的主要原因。导致SCNT胚胎的发育效率低的诸多原因中，早期胚胎细胞凋亡导致的发育停滞一直是一个重要原因。胚胎细胞的凋亡有利于去除发育异常的细胞，但是超出某种程度的凋亡则会导致胚胎发育停滞。大量的研究表明在附值前的胚胎中观察到过度凋亡的发生，凋亡的细胞发生皱缩，染色质凝集，DNA断裂。导致SCNT胚胎细胞过度凋亡的原因包括合子激活的异常、染色体的异常分离、卵母细胞、体外操作流程、培养环境。已经有研究表明，通过添加细胞因子IGF1、激素褪黑素、维生素C都能抑制克隆胚胎细胞的凋亡从而提高克隆胚胎的发育效率。
白细胞介素17(interleukin 17，IL17)是一类细胞因子家族，目前已有IL-17A-F等6个成员通过基因组测序和蛋白质组学鉴定并克隆。现有的研究表明IL17家族蛋白主要在免疫方面起到作用，主要是通过诱导细胞表达促炎细胞因子、趋化因子、抗菌肽，增强细胞免疫应答，参与炎症和黏膜宿主防御，在病菌感染、肿瘤发生中也具有一定的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高克隆胚胎发育质量的添加剂及其在提高克隆胚胎发育质量、提高动物克隆效率领域、抑制体外培养胚胎细胞凋亡上的应用。
本发明的一个方面，提供了一种提高克隆胚胎发育质量的添加剂，该添加剂包括IL17家族中的一种或多种细胞因子。
在某些实施方式中，提高克隆胚胎发育质量的添加剂为IL17D。
在某些实施方式中，提高克隆胚胎发育质量的添加剂IL17D浓度为50-100ng/mL。
在某些实施方式中，提高克隆胚胎发育质量的添加剂IL17D浓度为50ng/mL。
在某些实施方式中，提高克隆胚胎发育质量的添加剂IL17D在克隆胚胎激活后0h时添加。
本发明的另一个发明，提供了一种提高克隆胚胎发育质量的添加剂在提高克隆胚胎发育质量上的应用。该添加剂为IL17家族中的一种或多种细胞因子；优选地，该添加剂为IL17D；优选地，该添加剂为50-100ng/mL浓度的IL17D；优选地，该添加剂为50ng/mL浓度的IL17D；优选地，该添加剂为50ng/mL浓度的IL17D且在克隆胚胎激活后0h时添加。
本发明的第三个方面，提供了一种提高克隆胚胎发育质量的添加剂在提高动物克隆效率领域上的应用。该添加剂为IL17家族中的一种或多种细胞因子；优选地，该添加剂为IL17D；优选地，该添加剂为50-100ng/mL浓度的IL17D；优选地，该添加剂为50ng/mL浓度的IL17D；优选地，该添加剂为50ng/mL浓度的IL17D且在克隆胚胎激活后0h时添加。
本发明的第四个方面，提供了一种提高克隆胚胎发育质量的添加剂在抑制体外培养胚胎细胞凋亡上的应用。该添加剂为IL17家族中的一种或多种细胞因子；优选地，该添加剂为IL17D；优选地，该添加剂为50-100ng/mL浓度的IL17D；优选地，该添加剂为50ng/mL浓度的IL17D；优选地，该添加剂为50ng/mL浓度的IL17D且在克隆胚胎激活后0h时添加。
本发明的第五个方面，提供了一种利用提高克隆胚胎发育质量的添加剂来提高动物克隆效率的方法，其中，所述方法包括：制备融合激活的克隆重构胚胎；将激活后0h的克隆重构胚胎置于含有50ng/mL IL17D的PZM3基础培养基中培养；将培养发育至2细胞期的克隆重构胚胎置于代孕动物子宫内；经孕育生出克隆动物，提高克隆动物的出生率和健仔数。该添加剂为IL17家族中的一种或多种细胞因子；优选地，该添加剂为IL17D；优选地，该添加剂为50-100ng/mL浓度的IL17D；优选地，该添加剂为50ng/mL浓度的IL17D；优选地，该添加剂为50ng/mL浓度的IL17D且在克隆胚胎激活后0h时添加。
在某些实施方式中，利用提高克隆胚胎发育质量的添加剂来提高动物克隆效率的方法适用于猪、牛、羊、小鼠或其他哺乳动物。
本发明的有益效果：通过在体外克隆胚胎培养液中添加IL17D来抑制胚胎细胞的凋亡，进而提高克隆胚胎的发育质量，并应用于提高克隆胚胎发育质量、提高动物克隆技术效率领域、抑制体外培养胚胎细胞凋亡等领域，进而为更广泛地应用于畜牧生产、基因编辑研究等领域服务。
附图说明
图1为克隆胚胎的Hoechst33342染色结果和细胞凋亡检测(TdT-mediated dUTPNick-End Labeling，TUNEL)结果。
图2为经IL17D处理过的克隆胚胎的细胞凋亡结果。
图3为经IL17D处理过的克隆胚胎的部分凋亡基因的相对表达量结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
1、猪克隆胚胎的构建
卵母细胞成熟：将猪卵巢保存于37℃预热的含青霉素和硫酸链霉素的生理盐水中，使用18号针和注射器，挑选直径大小为5mm左右的卵泡抽取卵泡液，并让卵泡液在38.5℃的环境下自然沉降10min，去掉上清后加入DPBS重悬，重复上述步骤2次，取重悬液置于10cm培养板中，在体视镜下观察并用口吸管挑选合适的卵丘细胞-卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes,COCs)，挑选的COCs用成熟培养基清洗3次后转入已平衡4h的体外成熟培养基中，并用胚胎级矿物油覆盖。体外成熟培养基组分如下：基础培养基199(Gibco)，1g/L聚乙烯醇,3.05mM葡萄糖,0.91mM丙酮酸钠,0.57nM半胱氨酸,0.5μg/mL促黄体素,0.5μg/mL促卵泡激素,10ng/mL表皮生长因子,100mL/L猪卵泡液,75μg/ml青霉素(penicillin G),and 50μg/ml链霉素。COCs在38.5℃和5％CO2的培养箱中培养42-44h。将培养好的COCs置于含有1mg/mL透明质酸酶的DPBS的1.5mL离心管中，用移液枪轻柔地吹打，去除COCs中的卵丘细胞。最后挑选出胞质均匀、细胞形态圆润、卵间隙清晰及极体清晰的卵母细胞作为核移植实验的材料。
供体细胞准备：从35天的猪胎儿中分离胎儿成纤维细胞，分离好的细胞冻存于液氮中，在核移植实验前2-3天将胎儿成纤维细胞从液氮罐中取出复苏，在12％FBS的培养基中培养，在38.5℃，5％CO2的培养基中养至90％的汇合度。用胰蛋白酶消化之后重悬于显微操作液中备用。
克隆重构胚胎融合激活：卵母细胞通过盲吸去核，去除第一个极体及其周围组织。在显微镜下挑选形态较好的供体细胞将其细胞核从原切口注入去核卵母细胞的卵黄周，获得克隆重构胚胎。克隆重构胚胎培养在porcine zygote medium-3(PZM3)培养基中38.5℃、5％CO2培养4h，之后进行融合激活。PZM3培养液成分如下：NaCl 108.00mM、KCl 10.00mM、KH2PO40.35 mM、MgSO4·7H2O 0.40mM、NaHCO325.07 mM、丙酮酸钠(Na-Pyruvate)0.20mM、乳酸钙2.00mM、牛磺酸(Hypotaurine)5.00mM、L-谷氨酰胺1.00mM、必需氨基酸20mL/L、非必需氨基酸10mL/L。。设置电融合仪参数为150v/mm、100μs、2DC，采用融合－激活液清洗电融合槽，加入融合激活液500μL，转移10枚克隆重构胚胎至电融合槽内，用玻璃细针转动使卵受体－核供体轴线与电极相垂直，进行克隆重构胚胎的融合激活。
2、猪克隆胚胎的体外培养及克隆效率结果分析
2.1体外培养基PZM3的处理
向PZM3基础培养液中，分别添加0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的IL17D蛋白，孵育44h备用。
2.2关于融合激活后0h(0小时)补充IL17D对克隆胚胎发育的影响
在克隆胚胎激活后0h即置于装有添加了IL17D的体外培养基PZM3的培养板中。该克隆胚胎培养至48h、64h和168h时记录卵裂数、4细胞数、囊胚数。收集囊胚，分别放入含10μg/ml Hoechst33342的DPBS染色10min后在荧光显微镜下观察囊胚内细胞数。结果如表1所示，添加50ng/mL或100ng/mL浓度IL17D的体外培养基PZM3培养的克隆胚胎发育效率均比对照组(0ng/mL IL17D)有所提高，其中50ng/mL IL17D处理组培养的克隆胚胎的早期发育效率最高，与对照组相比，其4细胞率提高了37.7％，囊胚率提高了66.2％。
表1不同浓度的IL17D对克隆胚胎发育效率的影响
2.3胚胎激活后不同时间段补充IL17D对克隆胚胎发育的影响。
根据2.2中的结果，50ng/mL IL17D处理组为最佳浓度组。因而，在胚胎激活后分别在无IL17D的PZM3基础培养基中培养0h(0小时)、24h(24小时)、48h(48小时)，然后更换至含有50ng/mL IL17D的PZM3培养基，对照组NC组全程用无IL17D的PZM3培养液，继续培养至48h、64h和168h时记录卵裂数、4细胞数、囊胚数和囊胚细胞数。结果如表2所示，激活后0h添加IL17D的PZM3培养的克隆胚胎发育效率最优，其次是24h组，而48h添加IL17D对胚胎发育无促进作用。
表2胚胎激活后不同时间段添加IL17D对克隆胚胎发育效率的影响
2.4 IL17D对囊胚细胞凋亡的影响。收集经IL17D处理过的克隆胚胎，进行TUNEL和qPCR检测。相对对照组，IL17D处理组的囊胚凋亡细胞的数量水平得到显著降低，结果如图1、2所示。进一步地qPCR检测了多个凋亡相关基因，结果显示IL17D处理组的囊胚的促凋亡基因BCL2L11的表达下调，而抑凋亡基因BCL2表达得到上调，结果如图3所示。可见IL17D可以降低胚胎细胞的凋亡，进而提高克隆胚胎的发育质量，提高克隆效率。
以上所述的内容仅是本发明的一些实施。对本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外，以上所述的本发明的实施方式不但可用于提高猪克隆胚胎的发育出生效率，还可以用于提高其它动物，例如小鼠、羊、牛和猫等的克隆胚胎的发育出生效率，这些也都属于本发明的保护范围。
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