具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本实施例中使用的试剂如表1所示。

表1试剂

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂对圆形精子注射胚胎发育效率的提升效果

1.卵母细胞收集

(1)提前准备卵子保存皿：用直径为3.5cm进口Eppendorf胚胎培养皿，每个皿用M16培养基做8个30μL的培养滴，添加2.5mL石蜡油，没过培养液，放入培养箱(37℃、5％CO₂)预平衡3h。

(2)挑选发情间期的10周龄B6D2F1雌鼠(由DBA/2N雄鼠与C57BL/6N雌鼠交配得到的F1子代，C57BL/6N，DBA/2N购买自维通利华)，体重大约18～25g。按照体重计算注射激素的单位，每20g体重注射8U；当日晚上7点半左右腹腔注射孕马血清促性腺激素(Pregnantmare serum gonadotropin,PMSG)，并在PMSG启动48h后再注射人绒毛膜促性腺激素(Humanchorionic gonadotropin，HCG)以诱导超数排卵；HCG注射后13.5h取卵。

(3)取卵前，提前将M2培养基、透明质酸酶溶液预热到37℃，在无菌培养皿中放入100μL M2培养基，备用；对小鼠进行颈椎脱位安乐死，腹面朝上，75％酒精消毒后延腹中下部剪开皮肤，向头和尾部撕开，移去消化道，暴露子宫卵巢输卵管。超排成功的输卵管可肉眼见到膨大部，呈透明囊泡状，用眼科镊夹住输卵管与子宫连接处，贴近卵巢用眼科剪剪断卵巢和输卵管的连接处，贴近眼科镊剪断输卵管与子宫连接处，最后将输卵管转至M2培养基中。

(4)体视镜下用1mL注射器针头划开输卵管壶腹部，从壶腹部分离卵母细胞复合物(COCs)。

(5)将卵母细胞复合物(COCs)转移到200μL含1mg/mL透明质酸酶的M2培养基中，在在提前预热好的37℃体视镜热台上消化1分钟，期间用200μL含1mg/mL透明质酸酶的M2培养基中消化1分钟，以200μL微量移液枪辅助吹吸(注意不要吹出气泡)；1分钟后见卵母细胞周围的颗粒细胞大部分脱离；镜下用口吸管快速挑选卵母细胞，在三个新的100uL M2培养基胚胎操作液滴里分别清洗三次，每次将卵母细胞在液体上部画圈吹开，因为卵母细胞与颗粒细胞的沉降速率不同，在卵母细胞沉降而颗粒细胞漂浮时，快速挑选卵母细胞，以尽快中和、去除透明质酸酶、去除颗粒细胞。

(6)将边缘折光明显，胞质均质透亮，极体明显，透明带宽度适宜的优质MII卵母细胞(成熟的卵母细胞)全部转移到步骤(1)制备的添加石蜡油的M16培养基中短暂培养，用于后续显微注射。

2.圆形精子收集

(1)取10周B6D2F1雄鼠(由DBA/2N雄鼠与C57BL/6N雌鼠交配得到的F1子代，C57BL/6N，DBA/2N购买自维通利华)分离睾丸，体重20～25g，对小鼠进行颈椎脱位安乐死，腹部向上将小鼠放在手术盘中，75％乙醇喷洒在小鼠腹部进行消毒。先用剪刀在下肢上端水平线位置剪开皮肤，做一个1.5cm左右的横切口，再在腹壁肌肉层做一小切口，用剪刀钝性分离肌层，暴露出腹腔。钝镊子轻轻夹住一侧睾丸脂肪垫，连带睾丸、附睾和输精管一同拉出切口，分离睾丸，剥去睾丸白膜后用PBS洗2遍。

(2)将睾丸转移至无菌生物安全柜，弃去液体，用眼科剪将组织剪碎成匀浆状，加入1mL0.25％胰酶，37℃培养箱消化7分钟，镜下见大部分细胞从管腔中分离，加入4mL的小鼠成纤维细胞培养基(DMEM(12800017，Life Technologies)+10％FBS(SE200-ES,VISTECH))终止消化。

(3)组织悬浊液经40μm细胞筛(Falcon，352340)滤后转至15mL离心管，离心力348g，离心3分钟后弃上清，加入4mL小鼠成纤维细胞培养基(DMEM(12800017，LifeTechnologies)+10％FBS(SE200-ES,VISTECH))重悬细胞沉淀，加入Hoechst 33342(终浓度2.5μg/L)，37℃水浴锅中避光放置，染色15分钟，期间颠倒混匀3次防止细胞粘连。

(4)再次离心(离心力348g下离心3分钟)后用1mL流式分选细胞保存液(PBS+4％FBS(SE200-ES，VISTECH)重悬，40μm细胞筛滤至流式管，以去除悬液中的粘连细胞，保证上样前为单细胞悬液。

(5)利用流式细胞分选仪，分选睾丸细胞中的单倍体，即圆形精子。

3.圆形精子注射

(1)配制小分子浓储：SGC0946粉末(购置于Target Mol公司，CAS：1561178-17-3，产品编号：T3082)溶于DMSO，终浓度10mM，小体积分装，保存于-80℃，避免反复冻融，短期存放4℃，使用时配置SGC0946终浓度为1μM的卵母细胞激活液或KSOM培养液(对照组为加入等量DMSO的激活液或KSOM培养液)，卵母细胞激活液的组分如下：氯化钠4.77g/L、氯化钾0.36g/L、磷酸二氢钾0.16g/L、七水硫酸镁0.29g/L、碳酸氢钠2.11g/L、六水氯化锶2.666g/L、牛血清白蛋白3.00g/L、乙二胺四乙酸二钠0.041g/L、丙酮酸钠0.03g/L、谷氨酰胺0.5％(v/v)、青霉素-链霉素1％(v/v)、乳酸钠0.45％(v/v)；KSOM培养液中包含1％(v/v)GlutaMAX^TM添加剂、2％(v/v)BME氨基酸溶液；现配现用。

(2)注射前15分钟，将第1步收集的卵母细胞放入添加了SGC0946的卵母细胞激活液中进行预激活，注射前五分钟放入含有细胞松弛素B(终浓度5μg/mL)的M2培养基，改善胞膜韧性。

(3)注射前5分钟将流式分选得到的圆形精子细胞放入含有细胞松弛素B(终浓度5μg/mL)的M2培养基中自由沉降。

(4)用固定针拨动卵母细胞使其极体处在11点～13点的位置，用压电破膜仪(piezo)大脉冲辅助注射针破卵母细胞透明带，用注射针吸入圆形精子细胞，吸破胞膜，只留下圆形精子核，再次用压电破膜仪(piezo)小脉冲破卵母细胞胞膜，用注射针将圆形精子核注射入MII期卵母细胞胞质后，退出并吸少量胞质，将卵母细胞破口封起来。

(5)注射完成后，用步骤(1)配制的SGC0946终浓度为1μM的卵母细胞激活液清洗三次，以去除细胞松弛素B，并继续激活5小时，再转入添加了SGC0946的KSOM培养液中共培养15h(37℃，5％CO₂)，并观察胚胎发育情况。

(6)小分子作用撤除：共培养20小时后，更换新的已平衡二氧化碳浓度3h以上的KSOM培养液，在胚胎发育到4细胞晚期，更换到新的已平衡二氧化碳浓度3h以上的KSOM培养液中培养至囊胚。

(7)观察囊胚发育率：注射后94h，计算囊胚发育率。

结果如表2及图1所示：小分子化合物SGC0946对圆形精子注射胚胎的囊胚发育率有提升效果：囊胚发育率由33.70％提升至53.26％。

表2 SGC0946对圆形精子注射胚胎发育率的影响

注：a：p value<0.05，B6D2F1x B6D2F1品系中，添加SGC0946组囊胚发育率显著高于DMSO组。

实施例2组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂的浓度和作用时间对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的影响

1.组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂的浓度对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的影响

本试验过程与实施例1中第1、2、3步相同，区别仅在于：

(1)本试验过程第3步激活液和KSOM培养液中组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂SGC0946的浓度分别为500nM、1μM、2μM，各处理重复3次。

结果如图2所示：浓度为1μM的组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂SGC0946对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的促进效果优于浓度为500nM、2μM的组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂SGC0946及对照组(DMSO)，1μM的组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂SGC0946处理后，圆形精子注射胚胎囊胚发育率为50.59％。

2.组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂处理圆形精子胚胎的时间对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的影响

本试验过程与实施例1中第1、2、3步相同，区别仅在于：

(1)本试验过程第3步(5)中含组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂的卵母细胞激活液和KSOM培养液处理的时间总和不同：图3中“SGC0946 0-10h”表示注射后用含SGC0946的卵母细胞激活液激活5小时，然后用KSOM培养液共培养5h；“SGC0946 0-20h”表示注射后用含SGC0946的卵母细胞激活液激活5小时，然后用KSOM培养液共培养15h；“SGC09460-44h”表示注射后用含SGC0946的卵母细胞激活液激活5小时，然后用KSOM培养液共培养39h；“DMSO”表示对照：注射后用只含相同体积比的溶剂DMSO的卵母细胞激活液激活5小时，然后用只含相同体积比的溶剂DMSO的KSOM培养液共培养15h，各处理重复3次。

结果如图3所示：组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂SGC0946在注射圆形精子的卵母细胞激活后0～20h内处理，圆形精子注射胚胎囊胚发育率最佳。

实施例3组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的提升效果

本试验过程与实施例1中第1、2、3步相同，区别仅在于：

(1)本试验过程中含组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂的化学激活液和KSOM培养液中DNA甲基转移酶的种类和浓度不同：图4中：“ROSI”表示未经任何处理；“+DMSO”表示加入等量DMSO；“SGC0946-1μM”表示浓度为1μM的SGC0946；“EPZ0047777-1μM”表示浓度为1μM的EPZ0047777(CAS号：1338466-77-5)；“EPZ5676-1μM”表示浓度为1μM的EPZ5676(CAS号：1380288-87-8)。

结果如图4所示：组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂SGC0946能显著提高圆形精子注射胚胎囊胚发育率。

实施例4组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂A366的浓度和作用时间对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的影响

1.组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂A366的浓度对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的影响本试验过程与实施例1中第1、2、3步相同，区别仅在于：

(1)本试验过程第3步激活液和KSOM培养液中组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂A366的浓度分别为150nM、300nM、600nM，各处理重复3次。

结果如图5所示：浓度为150nM、300nM的组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂A366对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的促进效果优于浓度为600nM的组蛋白甲基转移酶抑制；尤其浓度为300nM的组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂A366处理后，圆形精子注射胚胎囊胚发育率接近60％。

2.组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂A366处理圆形精子胚胎的时间对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的影响

本试验过程与实施例1中第1、2、3步相同，区别仅在于：

(1)本试验过程第3步(5)中含组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂A366的卵母细胞激活液和KSOM培养液处理的时间总和不同：图5中：“DMSO”表示对照：注射后用只含相同体积比的溶剂DMSO的卵母细胞激活液激活5小时，然后用只含相同体积比的溶剂DMSO的KSOM培养液共培养15h；“A366 0-10h”表示注射后用含A366的卵母细胞激活液激活5小时，然后用KSOM培养液共培养5h；“A366 0-20h”表示注射后用含A366的卵母细胞激活液激活5小时，然后用KSOM培养液共培养15h；“A366 0-44h”表示注射后用含A366的卵母细胞激活液激活5小时，然后用KSOM培养液共培养39h；各处理重复3次。

结果如图6所示：组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂A366在注射圆形精子的卵母细胞激活后0～20h内处理，圆形精子注射胚胎囊胚发育率最佳。

实施例5组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂A366对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的提升效果

本试验过程与实施例1中第1、2、3步相同，区别仅在于：

(1)本试验过程中含组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂的化学激活液和KSOM培养液中组蛋白甲基转移酶的种类和浓度不同：图7中：“DMSO”表示用等量DMSO处理；“A366-300nM”表示浓度为300nM的A366；“A366-150nM”表示浓度为150nM的A366；“BIX01294-200nM”表示浓度为200nM的BIX-01294(CAS号：935693-62-2)；“BIX01294-100nM”表示浓度为100nM的BIX-01294；“BRD4770-2.5μM”表示浓度为2.5μM的BRD4770；“BRD4770-1.25μM”表示浓度为1.25μM的BRD4770；“UNC0631-80nM”表示浓度为80nM的UNC0631(CAS号：1320288-19-4)；“UNC0631-40nM”表示浓度为40nM的UNC0631。

结果如图7所示：组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂A366、浓度为200nM的BIX-01294、BRD4770均能提高圆形精子注射胚胎囊胚发育率。

实施例6联合使用组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂和组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂对圆形精子注射胚胎发育潜能的提升效果

本试验过程与实施例1中第1、2、3步相同，区别仅在于：

(1)本实验过程中还包括采用DBA/2N雄鼠与C57BL/6N雌鼠，DBA/2N雄鼠与C57BL/6N雌鼠均购自北京维通利华。

(2)本试验过程第3步激活液和KSOM培养液中：1)同时含有组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂A366和组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂SGC0946：终浓度分别为300nM、1μM；2)仅含有组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂A366，终浓度为300nM。

结果如图1及表3所示：联合使用组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂和组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂可以显著提高囊胚发育率(66.67％，B6D2F1品系；41.18％，DBAxC57品系)，较单用组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂A366(58.93％)和单用组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂SGC0946(53.26％)效果更好(B6D2F1品系)。

表3.SGC0946与A366联合应用对圆形精子注射胚胎的囊胚发育率的影响

注：a：p value<0.05，B6D2F1xB6D2F1品系中，添加A366组囊胚率显著高于DMSO组；bb:p value<0.01，B6D2F1xB6D2F1品系中，添加SGC0946+A366组囊胚率显著高于DMSO组；ccc:p value<0.001,DBAxC57品系中添加SGC0946+A366组囊胚率显著高于DMSO组。

(3)将品系C57xDBA圆形精子注射的二细胞胚胎移植，步骤如下：

雄鼠结扎：取4～5周龄昆明雄鼠，体重25～35g，购买自广东省实验动物中心；称重并用1％戊巴比妥钠(0.8mg/kg)经腹内注射使其麻醉，腹部向上将小鼠放在手术盘中，75％乙醇喷洒在小鼠腹部进行消毒；先用剪刀在下肢上端水平线位置剪开皮肤，做一个1.5cm左右的横切口，再在腹壁肌肉层做一小切口，用剪刀钝性分离肌层，暴露用下腹腔。钝镊子轻轻夹住一侧睾丸脂肪垫，连带睾丸、附睾和输精管一同拉出切口。输精管伴行有血管，小心钝性分离其周边筋膜以避免损伤周边血管，一把镊子撑开输精管，两端手术线结扎后，高温镊子将中段输精管烧烙掉，见输精管变白变硬。术后将肌肉层提起，让睾丸组织自然滑落至腹腔，重复上述步骤处理另一侧输精管。使用医用真丝缝合线分别缝合腹肌层及皮肤；输精管切除术后两周取发情雌鼠与其交配，以母鼠是否能怀孕，检测雄鼠是否已丧失生育能力。

准备假孕母鼠：假孕小鼠采用ICR雌鼠，8周龄，体重25～35g，购买自广东省实验动物中心；移植前一天取发情期ICR雌鼠与结扎公鼠交配，次日早上8点前检栓，如果雌鼠阴道口检查出有白栓块，视为假孕0.5天。

2细胞期胚胎输卵管移植：称重并用1％戊巴比妥钠(0.8mg/kg)经腹内注射使其麻醉，小鼠左侧卧位，在背中央右侧旁开1cm出，大腿上方1cm处剪开皮肤，透过肌层能隐约看到脂肪垫，肌层钝性分离出0.5cm小口，夹住脂肪垫将卵巢拉出腹腔，脂肪夹固定，暴露壶腹部，在体式镜下，用1mL注射器在壶腹部上方开一小口恰好放入口径100μm的口吸管，口吸管吸取四段液体，中间吸入三段空气，在第三段液体中吸入胚胎，插入小口，向壶腹部方向吹入胚胎，移植顺利能看到三个小气泡聚集在输卵管壶腹部，每只受体老鼠单侧输卵管移植14个胚胎(上述获得的C57xDBA品系胚胎)，缝合肌层和皮肤，注意不要夹伤输卵管卵巢子宫，尽量夹脂肪垫以固定输卵管，移植19.5天后，对受体雌鼠进行剖宫产，将胎儿，胎盘取出，称重、拍照记录；结果如图8及表4所示：联用SGC0946和A366可以显著提高圆形精子注射胚胎着床率和活产率。

表4.SGC0946与A366联合应用对圆形精子注射胚胎着床率和活产率的影响

注：a:P<0.05，DBAXC57品系中，添加SGC0946与A366联合孵育的圆形精子注射胚胎着床率显著高于DMSO组；b:P<0.05，DBAXC57品系中，添加SGC0946与A366联合孵育的圆形精子注射胚胎着床率显著高于DMSO组。

统计出生体重与胎盘体重，结果如图9所示：图9中：“ROSI+DMSO”表示添加DMSO；“ROSI+AS”表示添加SGC0946和A366；n表示重复数；添加SGC0946和A366的圆形精子注射活产小鼠与DMSO组相比，出生体重和胎盘体重无明显差别。

以剖宫产前0～5天自然生产的ICR母鼠作为代养母鼠，代为哺乳，养育剖宫产活产的胎儿，继续观察后代是否可育，结果如图10所示：添加SGC0946和A366的圆形精子注射活产小鼠F01代可正常繁育后代。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。