一种蜡梅原生质体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种原生质体的制备方法，具体涉及一种蜡梅原生质体的制备方法。
背景技术
蜡梅(Chimonanthus praecox)是蜡梅科蜡梅属的名贵花木，是珍贵的冬季观花树种。近年来，人们对蜡梅的需求与日俱增，蜡梅的应用和市场不断扩大，蜡梅的性状遗传和改良成为科研和产业的重点，蜡梅作为木本植物，遗传转化体系难以建立，建立蜡梅的遗传转化体系对蜡梅花色、花香、抗逆等基因功能有重大意义，而原生质体提取正好是瞬时表达和遗传性状改良的一项基本技术。
植物的原生质体指的是植物细胞除去细胞壁后，裸露出的细胞膜包裹的原生质团部分。原生质体因为没有细胞壁隔绝外界环境，容易吸收导入的外源基因、染色体等遗传物质，能够克服有性生殖的障碍，制备时间短，能够快速观测表型，实现基因的表达，成为了分子生物相关实验中的理想受体。
蜡梅作为木本植物，生长周期长，植物结构复杂，目前还没有蜡梅原生质体制备的相关研究，仍然处于起步阶段。研究蜡梅原生质体提取技术，获取蜡梅原生质体提取的最佳材料、制备方法，对蜡梅瞬时转化体系的建立、遗传转化、体细胞杂交等有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种蜡梅原生质体的制备方法，以纤维素酶和离析酶的酶解液组合，以蜡梅愈伤组织为材料制备原生质体，不受取材时间、数量的影响，酶解可得到平均1.11×106个/g的蜡梅原生质体产量，高效快速。
为了达到上述目的，本发明提供了一种蜡梅原生质体的制备方法，该方法包含：在黑暗条件下培养蜡梅花药，诱导愈伤组织；将所述愈伤组织置于酶解溶液中，在振荡培养箱中黑暗培养，得到含原生质体的酶解液；其中，所述酶解溶液包含：纤维素酶和离析酶，纤维素酶的浓度为1.0～2.0％，离析酶的浓度为0.1～0.5％；在酶解液中加入适量W5溶液稀释，用细胞过滤器过滤；其中，所述W5溶液为氯化钠、氯化钙、氯化钾、2-(N-吗啉基)乙磺酸和水的混合液；将所得滤液离心，弃上清液，以获得含蜡梅原生质体的溶液。
优选地，诱导所述蜡梅花药的培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+1.0～2.0mg/L 2,4-D。
优选地，所述花药愈伤组织在黑暗条件下培养，温度为24±2℃，空气湿度为44％。
优选地，所述蜡梅花药为选取红心、素心或皱瓣基因型的蜡梅的花苞，经清洗和消毒后，取下花药；其中，所述清洗和消毒为，采用洗衣粉水浸泡，水洗，70％酒精浸泡，无菌水洗，0.1％氯化汞浸泡，无菌水洗。
优选地，所述纤维素酶的浓度为1.0％，离析酶的浓度为0.1％。
优选地，所述酶解溶液还包含：甘露醇、氯化钾、2-(N-吗啉基)乙磺酸、氯化钙和牛血清蛋白；其中，所述甘露醇的浓度为0.4mol/L，所述氯化钾的浓度为0.02mol/L，所述2-(N-吗啉基)乙磺酸的浓度为0.02mol/L，所述氯化钙的浓度为0.02mol/L，所述牛血清蛋白的浓度为1.0％。
优选地，所述愈伤组织于酶解溶液，在振荡培养箱中黑暗培养，温度为22℃，转速为70rpm/min。
优选地，所述愈伤组织的振荡培养时间为4～6h。
优选地，所述细胞过滤器为75μm细胞过滤器。
优选地，所述滤液的离心为为：200xg离心2min。
本发明的蜡梅原生质体的制备方法，具有以下优点：
本发明以蜡梅愈伤组织为材料制备原生质体，不受取材时间、数量的影响。本发明以纤维素酶+离析酶的酶解液组合，酶解4小时即可得到平均1.11×106个/g的蜡梅原生质体产量，高效快速。本发明所用不同蜡梅的基因型对原生质体的产量有显著差异，其中素心的原生质体产量可高达1.56×106个/g。本发明开辟了蜡梅原生质体制备技术，在此基础上可进行原生质体培养、瞬时转化、细胞融合等操作，对蜡梅基因功能的研究和遗传性状的改良具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例制备原生质体的材料。
图2为本发明实施例制备的原生质体细胞照片(10倍)。
图3为本发明实施例制备的原生质体细胞照片(40倍)。
图4为本发明实施例中原生质体产量与纤维素酶的关系。
图5为本发明实施例中原生质体产量与离析酶的关系。
图6为本发明实施例中原生质体产量与酶解时间的关系。
图7为本发明实施例中原生质体产量与植物基因型的关系。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中使用的试剂的制备如下：
0.8M甘露醇(100mL)：称取15.18g甘露醇粉末，蒸馏水溶解后，定容至100mL，4℃冰箱保存。
10％BSA(10mL)：称取1.0gBSA粉末，蒸馏水溶解后，定容至10mL，4℃冰箱保存。
0.2M MES(10mL)：称取0.3g MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)粉末，蒸馏水溶解后，定容至10mL，4℃冰箱保存。
1M氯化钾(10mL)：称取0.75g氯化钾粉末，蒸馏水溶解后，定容至10mL，4℃冰箱保存。
1M氯化钙(10mL)：称取11.1g氯化钙粉末，蒸馏水溶解后，定容至10mL，4℃冰箱保存。
1M氯化钠(100mL)：称取5.84g氯化钠粉末，蒸馏水溶解后，定容至100mL，4℃冰箱保存。
W5溶液(100mL)：量取1M氯化钠15.4mL，加入1M氯化钙12.5mL，1M氯化钾0.5mL，0.2M MES 1mL，混合均匀后，蒸馏水定容至100mL，4℃冰箱保存。
实施例1
蜡梅原生质体的制备，按照如下步骤：
(1)设计4因素3水平的正交试验表1如下：
表1不同酶解条件的正交试验设计(L943)
注：这些基因型均在华中农业大学采集。
(2)配制5mL酶解液：打开水浴锅，设置为55℃备用，按照表1称取适量的纤维素酶、离析酶，加入2.5mL 0.8M的甘露醇，0.1mL 1M的氯化钾，0.5mL 0.2M的MES。混合均匀后水浴锅中孵育10min，冷却至室温后加入0.1mL 1M的氯化钙，0.5mL 10％的BSA(牛血清蛋白)，蒸馏水定容至5mL，用0.45μm的过滤器过滤到锥形瓶中，现配现用。
(3)分别称取0.2g已继代培养10个月的‘红心’、‘素心’、‘皱瓣’蜡梅花药诱导的愈伤组织，放入配制好的5mL酶解液，用竹签轻柔搅碎。选取红心、素心或皱瓣基因型的蜡梅的花苞，经清洗和消毒后，取下花药，其中清洗和消毒为，采用洗衣粉水浸泡，水洗，70％酒精浸泡，无菌水洗，0.1％氯化汞浸泡，无菌水洗。将蜡梅花药诱导，诱导培养基为MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L 2,4-D或MS+1.0mg/L 6-BA+2.0mg/L 2,4-D，花药愈伤组织在黑暗条件下培养，温度为24±2℃，空气湿度为44％。
(4)将装有酶解液的锥形瓶固定在摇床上，在黑暗条件下，22℃，70r/min分别孵育4、5、6小时。
(5)在酶解液中靠壁缓缓加入1/2体积(2.5mL)的W5溶液，用一次性塑料滴管慢慢吸取酶解液，在75μm细胞过滤器上过滤，并用W5溶液洗涤滤网。
(6)将所得滤液在200g下离心2min，置于冰上，弃去上清液。再次加入剩余酶解液2倍体积的W5溶液，同等离心条件下离心2min，弃上清液，剩余约1mL酶解液，冰浴，得到含蜡梅原生质体的溶液。
在倒置显微镜下观测提取的原生质体细胞，并用血细胞计数板记录原生质体细胞数量(参见图1、图2)，重复3次。
原生质体产量的鉴定：用血细胞计数板计算原生质体产量，采用的血细胞计数板为十字格型，计数室为25个中格×16个小格，计数时数四角的中格+中间的中格共5个中格(5×16＝80个小格)的细胞数量。
大方格(0.1mm3)原生质体总数＝中格原生质体细胞平均数×25。
原生质体的密度(个/mL)＝大方格(0.1mm3)原生质体总数×104。
原生质体产量(个/g)＝(原生质体密度×原生质体悬浮液总体积)/所用愈伤的鲜重。
上述步骤(2)中，设置的纤维素酶浓度1.0％、1.5％、2.0％，结果显示，纤维素酶浓度为1.0％时即可达到较好效果，产量为1.17×106个/g(参见图4)。
上述步骤(2)中，设置的离析酶浓度0.1％、0.3％、0.5％，结果显示，离析酶浓度为0.1％时效果最好，原生质体的产量平均可以达到1.37×106个/g(参见图5)。
上述步骤(3)中，设置的酶解时间4、5、6小时，结果显示，酶解时间4-6小时时原生质体的产量无显著性差异，酶解4小时最佳，产量可以达到1.16×106个/g(参见图6)。
上述步骤(3)中，3种不同的蜡梅基因型，结果显示，素心原生质体的产量最高，可达到1.56×106个/g(参见图7)。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
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