具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所述，苹果作为一种多年生的落叶乔木，其细胞仅细胞壁的木质化程度就远大于其他木本植物和亚灌木植物，而木质化程度越高细胞壁就越厚越坚硬，在提取原生质体阶段就存在极大的困难；另一方面，液泡是单层膜细胞器，被原生质体包裹，且细胞膜与原生质体之间存在其他的细胞器，所以液泡的脆弱及其所在环境的复杂性也是实验的一个难点。

基于此，本发明提供一种木本植物苹果果实细胞液泡蛋白的提取方法。本发明中通过适当改良实验室原生质体提取方法，通过短时间的酶解，过滤沉淀后可提取出大量高纯度的原生质体。本发明中液泡提取部分利用含有高浓度聚蔗糖的裂解液使原生质体发生渗透休克，快速释放液泡，然后在不同浓度的聚蔗糖溶液中(由下至上分别为含30％聚蔗糖溶液的裂解缓冲液、4％的聚蔗糖溶液、不含聚蔗糖溶液的液泡缓冲液，三者保存在不同的温度中，且加入后不可混合，使原生质体发生热休克促进液泡释放并形成一个液泡释放和搜集的缓冲过程；聚蔗糖呈白色粉末状，无毒、无害)，进行超速离心分离得到液泡，本方法从多角度促进液泡释放，并通过超速离心快速搜集液泡，在短时间内可获得大量高纯度液泡，这是一种新颖快捷的液泡提取方法。本发明通过超低温冻融的方法破碎液泡，分离得到液泡蛋白，此方法简便快捷。本发明中通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测液泡蛋白，与现有的SDS-PAGE凝胶电泳相比，从所制作的浓缩胶和分离胶的浓度、调节电压的大小到所使用的染液(一种SDS-PAGE蛋白胶快速染液)等均有所不同。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

说明：实施例所用溶液的配置方法为：

(1)甘露醇(1M)：称量36.435g甘露醇固体，最后用ddH₂O定容至200ml。

(2)CaCl₂(1M)：称量22.196g CaCl₂固体，最后用ddH₂O定容至200ml。

(3)NaCl(5M)：称量58.44g NaCl固体，最后用ddH₂O定容至200ml。

(4)KCl(1M)：称量14.19g KCl固体，最后用ddH₂O定容至200ml。

(5)MgCl₂(1M)：称量40.66g MgCl₂固体，最后用ddH₂O定容至200ml。

(6)MES(0.5M)：称量21.32g MES固体，最后用ddH₂O定容至200ml。(将pH调节至5.7)

(6)EDTA(0.5M)：称量74.45g EDTA，最后用ddH₂O定容至400ml。(用固体NaOH调节pH至8.0)

(7)30％(wt)聚蔗糖溶液：称量4.5g聚蔗糖，最后用ddH₂O定容至15ml。

(注意：聚蔗糖非常难溶解，可以将其分成多次进行溶解，也可以将其放置在65℃水浴条件下短暂加热几分钟后让其自行溶解，也可以提前半天到一天让其在常温下自然溶解，切记加热温度不宜过高，加热温度不宜过长，否则会影响液泡裂解效果以及最后的分离和收集。)

(8)0.1％中性红溶液：加入0.1g中性红、200μl1％的乙酸、50μl氯仿，最后用ddH₂O定容至100ml。

(9)溶液A：称量6.24g NaH₂PO₄·2H₂O，最后用ddH₂O定容至200ml。

(10)溶液B：称量14.333g Na₂HPO₄·12H₂O，最后用ddH₂O定容至200ml。

(11)第一磷酸钠缓冲液(0.2M)：混合16ml溶液A和84ml溶液B。

(12)第二磷酸钠缓冲液(0.2M)：混合5.3ml溶液A和94.7ml溶液B。

(13)细胞壁酶解液(现配先用)：在带有刻度的50ml洁净离心管中加入4ml甘露醇(1M)、200μl KCl(1M)、402μl MES(0.5M)、0.2g蔗糖、0.15g纤维素酶R-10、0.04g离析酶R-10、0.005g果胶酶Y-23，最后用ddH₂O定容至10ml，不时轻晃使溶质彻底溶解。

(14)W5缓冲液(现配先用)：加入6.16ml NaCl(5M)、25ml CaCl₂(1M)、1ml KCl(1M)、0.8ml MES(0.5M)，最后用ddH₂O定容至200ml。

(15)MMG缓冲液(现配先用)：加入80ml甘露醇(1M)、3ml MgCl₂(1M)、1.6ml MES(0.5M)，最后用ddH₂O定容至200ml。

(16)裂解缓冲液(现配先用)：加入3ml甘露醇(1M)、5ml30％(wt)聚蔗糖、300μlEDTA(0.5M)、375μl第二磷酸钠缓冲液、75μl 0.1％中性红溶液、最后用ddH₂O定容至15ml，在37℃水浴下保温。

(17)液泡缓冲液(现配先用)：加入4.5ml甘露醇(1M)、250μl第一磷磷酸钠缓冲液、40μlEDTA(0.5M)、最终用ddH₂O定容至10ml，放置在冰上待用。

(18)4％聚蔗糖溶液(现配先用)：混合4.5ml液泡缓冲液、3ml裂解缓冲液，放置在室温条件下待用(25℃左右)。

(19)上样缓冲液：加入625ml 1.0M Tris-HCl(pH 6.8)，2ml甘油，2ml 10％SDS，1mlβ-巯基乙醇，0.5ml 0.1％溴酚蓝，最后加ddH₂O定容至10ml。

(20)分离胶缓冲液(1.5M，pH 8.8)：称量18.17g Tris，加入ddH₂O溶解，用6M的HCl将pH调节至8.8，最后用ddH₂O定容至100ml，在4℃条件下保存。

(21)浓缩胶缓冲液(1.0M，pH 6.8)：称量12.12g Tris，加入ddH₂O溶解，用6M的HCl将pH调节至6.8，最后用ddH₂O定容至100ml，在4℃条件下保存。

(22)30％凝胶储备液(30％Acrylamide)：称量29.9g丙烯酰胺(Acr)，0.8g亚甲基双丙烯酰胺(Bis)，最后用ddH₂O定容至100ml，瓶身用锡箔纸包裹住，在4℃条件下保存，30天内使用。

(23)脱色液：加入50ml甲醇，75ml冰醋酸，最后与875ml ddH₂O混合。

(24)10％SDS-PAGE分离胶配方(制作一块胶的量)：加入1.9ml ddH₂O，1.7ml 30％Acrylamide，1.3ml 1.5M Tris-HCl(pH8.8)，0.05ml 10％SDS，0.05ml 10％(W/V)过硫酸铵，0.02ml TEMED。

(25)5％Acrylamide SDS-PAGE浓缩胶配制(制作一块胶的量)：加入0.68mlddH₂O，0.17ml30％Acrylamide，0.13ml 1.0M Tris-HCl(pH6.8)，0.01ml 10％SDS，0.01ml10％(W/V)过硫酸铵，0.001ml TEMED。

(26)电极缓冲液：称量1g SDS，3g Tris，14.4g Gly，最后用ddH₂O定容至1000ml，现配现用；或者配制10倍不含SDS的浓缩液，在室温下保存，需要使用时再在每1000ml稀释液中加入1g SDS，充分溶解后使用。

实施例

(1)原生质体的提取

①酶解液的处理：配制原生质体酶解液，轻晃使其中的溶质溶解充分，待其完全溶解后，放入55℃水浴锅中加热10分钟(水浴锅需提前打开预热)，紧接着放在冰上冷却5分钟，然后加入100μl CaCl₂(1M)，轻摇晃匀，暂放室温条件下待用；

②释放原生质体：用干净的镊子取3-3.5g新鲜稚嫩的果肉，加入灭菌的培养皿中，并适当轻轻碾碎，再加入处理好的细胞壁酶解液，轻轻晃匀，用锡箔纸包裹作为避光处理，放在速度为70rpm的露天摇床上，室温下酶解2-3小时；

③分离和收集原生质体：直接在上步进行酶解细胞壁的培养皿中，使用1000μl带平滑剪口枪头的移液器加入等体积(一份材料的体系为10ml，即每份材料中加入10ml W5缓冲液)的W5缓冲液，轻轻将材料晃匀，再用200目尼龙网纱将其过滤进50ml圆底离心管中，再用5-10ml W5缓冲液冲洗滤网，将过滤好的材料在室温(25℃左右)下静置20-30分钟使原生质体自然沉降，也可用离心机(500rpm，10min，室温25℃左右)进行沉淀，然后使用1000μl带平滑剪口枪头的移液器小心吸取上清液，保留沉淀，再在保留沉淀的离心管中加入5-10mlW5缓冲液，轻轻晃匀，使沉淀重悬，再将其静置在室温(25℃左右)条件下20-30分钟使原生质体自然沉降，或者用离心机(500rpm，10min，室温25℃左右)进行沉淀，然后使用1000μl带平滑剪口枪头的移液器小心吸取上清液，保留沉淀。可将少量原生质体保留在MMG缓冲液中，以便于观察原生质体的状态和质量。

经检测和计算，每3-3.5g果肉可以获得500-700μl的原生质体沉淀(如图1所示)。

(2)液泡的提取

①释放液泡：直接在原生质体沉淀中加入5-6ml在37℃水浴下保温的裂解缓冲液(每3-3.5g果肉获得的原生质体为一份提取液泡所需的样品)，轻摇混匀，然后在室温条件下静置，静置15分钟左右进入离心状态；

②分离和收集液泡：再在每个样品中先加入3ml在室温条件下保存的4％聚蔗糖溶液，后加入1ml冰上保存的液泡缓冲液，在天平上将样品配平，离心(数据设置：71000g，10℃，50min)；

(注意：加液时要小心，避免弄混各个不同的溶液层)

③观察：离心结束后，根据出现的分离层，将各层用带有100μl平滑的剪口枪头的移液器将各个分离层小心分离，移入大小适宜的洁净离心管中，并做好标记避免弄混，再将各部分的溶液分别制片放在光学显微镜下观察。通过计算，所提取液泡含量约为100个/mm²。另外，为了更方便的观察苹果果实细胞原生质体，可以用0.1％的中性红(Sigma，货号N7005)溶液(0.1g中性红、200μl 1％的乙酸、50μl氯仿，最后用ddH₂O定容至100ml)染色5min后，然后制片放在光学显微镜下观察。经观察和计算，液泡提取量约为100个/mm²(如图2所示)。

(3)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

①超速离心后对材料的处理：通过光学显微镜确定含有大量液泡的分离层，将该部分做好标记放入-80℃冰冻，经过一定时间将其中的液泡冻碎，取出后放置在冰上融化，待其完全融化后，用移液器取100μl的量于洁净的1.5ml离心管中，再在其中加入25μl的上样缓冲液，充分混匀以后，卡在两层泡沫板中，并在管口装上防爆装置，在沸水中煮制8分钟，煮制完成后即可使用，如果不能马上使用，则需保存在在-20℃条件下；

②制胶：选择洁净干燥的垫条玻璃和薄玻璃各一块配成一套，将二者重叠，中间形成一块空隙，垂直放入制胶支架，在平整的桌面上将垫条玻璃和薄玻璃的低端对其，再将制胶支架两侧的锁紧门向两侧旋转锁紧，即完成一个制胶单元(注意：固定玻璃板时，两块玻璃板重叠的底部要尽可能对齐，手指触之平滑，尽量在平整的操作台上进行，否则注胶后会漏胶严重，从而影响后续实验操作)，再将准备好的制胶单元的底部紧紧压到制胶固定架的密封橡胶条上，并使制胶支架的后边尽量靠近制胶固定架，打开上方弹簧夹将玻璃板上缘紧紧夹住(如果夹的不紧，或者橡胶条性能不好均会导致后续漏胶)，至此玻璃板固定完成。按配方制作下层分离胶溶液，使用1000μl移液器将其注入两块玻璃板之间的缝隙中，用ddH₂O将剩下的空间填满并赶出注胶时产生的气泡。等待分离胶凝固(大概20-30分钟后，下层分离胶与上层的水会出现明显的分界线，可以观察到胶的渗漏程度，根据分界线的高低决定继续后续工作或重新制作，如果需要重新制作，检查固定装置更换可能有影响的配件)，如果下层分离胶可用，就将分离胶上层的水倒掉，并用滤纸小心吸干内部不易倒出的水分，注意不要戳到分离胶；将上层水处理好后，立即按照配方配制上层浓缩胶，使用1000μl移液器将其注入两块玻璃板之间的缝隙中(注意尽量不要出现气泡，如果出现气泡用移液器将其吸出或者用注射器将其赶出)，立即插入所需厚度和齿数的梳子，待胶凝固后即可使用；

③准备电极缓冲液：取100ml室温条件下保存的10倍电极缓冲液，稀释到1000ml，再加入1g SDS粉末，用充分搅拌使其溶解待用。(SDS粉末容易飞粉，且吸入有害，加该粉末时应该佩戴好口罩且操作迅速以避免吸入)；

④装配电泳装置：胶凝固后，不需要拔掉梳子，取出制胶单元，打开制胶支架上的紧缩门，将玻璃板从制胶支架中取出，移入电泳槽；将已制完的一组玻璃板(薄玻璃板的一向着内侧)和一块替代塑料片分别装入电极架的两侧，将二者的底部架在电极架支架上，捏拢卡紧，形成一个完整的密封凹槽(固定时，玻璃板和塑料片左上角与右上角的小凹槽，要与固定装置上的凸起对齐，以免加入电极缓冲液之后发生渗漏)；将组装完的电极架插入垂直槽槽内固定架，并确认电极架与垂直槽的正负极和卡槽相对应；

⑤跑胶：在内槽中加满电极缓冲液，可溢出少部分于外槽，小心将梳子拔出，将蛋白样品和蛋白marker按照一定的顺序加入梳井中，每孔10μl，也可根据蛋白样品的浓度进行适当调整；最后盖好上盖，保证电极架的正负极与槽盖的正负极始终对应，接通电泳仪并调节电压(样品跑到浓缩胶和分离胶分界面之前调节电压为110V，到达该分界面时调节电压为130V，直到观察样品接近分离胶底部时停止即可)；

⑥染色、观察和脱色：使用结束后，断开电源，用清水冲洗电泳槽和电极架，平放在桌面上晾干，用胶铲小心撬开薄玻璃板，将蛋白胶小心取出，放在大号培养皿中并倒入适量能没过蛋白胶的SDS-PAGE蛋白胶染液(购自北京睿博兴科生物技术有限公司，cat：RB010-500，lot.No:RBA00117)，至少染色5分钟，再在仪器下观察是否出现被染色的蛋白条带，如果出现明显的条带，将胶放入脱色液中至少脱色2小时以便于观察(如图3所示)。液泡蛋白提取浓度约为1μg/ml。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。