一种提高有效成分含量的杜仲悬浮细胞培养方法
技术领域
本发明属于生物
技术领域
，具体是涉及一种提高有效成分含量的杜仲悬浮细胞培养方法。背景技术
将诱导形成的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养称为悬浮培养，得到的物质为悬浮细胞。利用悬浮细胞可以生产出各种次生代谢物质。为了实现悬浮细胞能够生产出高产量的目标代谢产物，一般从几个方面进行改进，比如选育高产细胞系，添加诱导子。
杜仲细胞悬浮培养及主要次生代谢物积累的研究，邱晓芳，江西师范大学学位论文，描述了诱导子的种类，包括糖蛋白类，如糖基化的氧化牛血清白蛋白和氧化溶菌酶，蛋白质类诱导子，如果胶酶及链状蛋白酶，多糖类诱导子，如镰刀菌菌丝体、乙烯、水杨酸、几丁质和脱乙酰几丁质及其低聚糖，微生物类诱导子，如真菌诱导子，金属离子，如铜、钙、镁离子等。
杜仲为名贵中药，其次生代谢产物主要包括木脂素类、环烯醚萜类、黄酮类、苯丙素类、多糖、酚类、三萜类、甾类、有机酸、氨基酸、微量元素等，其通过试验得到杜仲细胞悬浮系优化得到最佳的培养条件为，B5+0.5mg/L NAA，0.6mg/L 6-BA，3％蔗糖为碳源，pH5.52，培养周期为12天。初始最佳接种量为1.6g·DCW/L。其代谢产物中最大值分别为黄酮16.63mg/g(113.08mg/L)和绿原酸3.93mg/g(26.57mg/L)。杜仲叶片愈伤组织诱导及增殖培养条件的优化，科学技术与工程，第13卷第7期，探讨了6-BA、NAA、2，4-D和PVP四种物质组合对杜仲愈伤组织及细胞的影响。结果表明：(1)这四种物质对杜仲愈伤组织诱导的影响顺序是6-BA>NAA>PVP，对增殖的影响顺序是6-BA>NAA>2,4-D。利用杜仲叶片诱导愈伤组织最佳培养基为MS+0.5mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA+2％PVP。
杜仲细胞培养生产次生代谢物的研究，朱媛，华南理工大学硕士学位论文，研究了添加物对悬浮细胞生长和桃叶珊瑚苷含量的影响，结论表明：糖类是影响植物组织培养成功与否的关键之一，糖的种类和用量不仅影响培养物生长速度和生长量，而且影响其代谢水平和次生代谢物的合成。以蔗糖为碳源时，最适于细胞的生长，且桃叶珊瑚苷含量最大，其它两种碳源的效果都不如蔗糖。但是蔗糖对桃叶珊瑚苷的生成有一定的抑制作用。桃叶珊瑚苷积累的条件初步优化结果为：MS+20g/L蔗糖+pH 5.8+2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA，此时桃叶珊瑚苷含最最高可达60mg/L。添加100mg/L水解酪蛋白和15mg/L酵母提取物均能促进桃叶珊瑚苷的合成。绿原酸的含量在第15d达到最高，绿原酸积累的条件初步优化结果为：MS+35g/L蔗糖+pH 5.3+1.0mg/L 6-BA。添加400mg/L水解酪蛋白和10mg/L酵母提取物均能促进绿原酸的合成。前体物的添加对次生代谢物的合成有一定的影响，可对此进行不同浓度梯度的分析，以提高次生代谢物的含量。
H2O2对杜仲愈伤组织中黄酮含量及过氧化物酶活性的影响，邓云云等，分子植物育种，2018年，第16卷第3期，研究表明5-10mmol/L H2O2培养杜仲愈伤组织10d时总黄酮含量最高，当杜仲愈伤组织培养5-10d、外源H2O2浓度为10mmol/L时的POD活性最高。相关性分析表明，杜仲愈伤组织总黄酮含量与POD活性之间的相关系数为r＝0.42061，具有一定的相关性，推测5-10mmol/L H2O2可通过提高杜仲愈伤组织中POD酶活性，刺激黄酮的积累。
GC-MS/SIM法测定不同产地杜仲叶中的氨基酸，周芳等，中南药学2012年4月第10卷第4期，研究了杜仲叶中不同产地的氨基酸含量，总氨基酸含量最高为9.95％。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提高有效成分含量的杜仲悬浮细胞培养方法，可以有效的提高杜仲悬浮细胞中过氧化物酶活力，提高氨基酸等物质的含量。
本发明的内容为一种提高有效成分含量的杜仲悬浮细胞培养方法，包括如下步骤，
1)将杜仲无菌苗的幼茎或幼叶接种于培养基中培养，诱导得到杜仲愈伤组织，所述培养基中添加有植物生长调节剂；
2)将杜仲愈伤组织接种于培养基中培养，得到杜仲悬浮细胞，所述培养基中添加有植物生长调节剂；
3)在杜仲悬浮细胞中加入真菌多糖，或真菌多糖和茉莉酸甲酯的混合物，继续培养，得到提高有效成分含量的杜仲悬浮细胞。
优选的，真菌多糖的添加量为70-90mg/L，或者，真菌多糖的添加量为30-50mg/L且茉莉酸甲酯的添加量为80-120μM/L。
优选的，所述真菌多糖的制备方法为，将葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea进行发酵培养，收集菌丝体，干燥，得菌丝体干燥物；加水回流提取，过滤，滤液和乙醇混合，静置，过滤，沉淀加水溶解后，洗脱蛋白，离心，收集上层溶液，冷冻干燥后得到真菌多糖。
优选的，步骤1)和步骤2)的培养基为B5培养基。
优选的，植物生长调节剂为6-BA，以及NAA或2,4-D的混合物。优选的，植物生长调节剂为6-BA和NAA的混合物。
优选的，6-BA的添加量为0.8-1.2mg/L，NAA的添加量为0.8-1.2mg/L，2,4-D的添加量为0.5mg/L。
本发明的有益效果是，本发明通过在杜仲悬浮细胞中加入真菌多糖，或真菌多糖和茉莉酸甲酯的组合物，诱导杜仲悬浮细胞大量产生活性成分，活性成分主要为过氧化物酶、氨基酸、牛蒡子苷、柚皮苷和橙皮苷，为大规模工业化生产奠定基础。
附图说明
图1为固体培养基诱导愈伤组织图片。
图2为愈伤组织液体培养诱导悬浮细胞图片。
图3为不同诱导处理组杜仲悬浮细胞内POD酶活OD值变化曲线。
图4为不同处理组杜仲悬浮细胞样品的TIC图。
图5为不同处理组样品中各特征离子EIC图峰面积图。
在图4中，A为SA(水杨酸)处理组；B为MeJA(茉莉酸甲酯)处理组；C为空白组；D为真菌多糖处理组。
具体实施方式
实施例1
真菌多糖诱导子的制备
选择葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)进行菌丝的发酵培养，发酵量为3L，离心，收集菌丝体干燥。取菌丝体干燥物，12倍量水回流提取1-2h(100℃水浴)，滤过，滤液加4倍量75-80％体积浓度乙醇静置过夜，滤过，沉淀加水(水的重量为沉淀物重量的10倍)溶解后，采用Sevage法(溶剂为氯仿/正丁醇(体积比为4:1)溶液)脱蛋白，震荡20min，离心，将上层溶液冷冻干燥，得到真菌多糖，备用。
实施例2
杜仲悬浮细胞的培养
采集新鲜的杜仲果荚，用剪刀将杜仲果荚中的种子取出，用体积浓度为75％的酒精擦试表面，进行表面消毒。于超净工作台内，在无菌条件下，用70％体积浓度乙醇处理30s，后无菌水冲洗3～5次。再用6％质量浓度次氯酸钠溶液处理3～5min，无菌水冲洗5～6次，最后用0.1％质量浓度升汞水溶液浸泡6～10min，无菌水冲洗5～6次，后接种到培养基中培养。种子萌发后的无菌苗用于杜仲愈伤组织的诱导实验，取其幼嫩茎叶。
不同培养基对杜仲种子萌发的影响
采用MS、B5、WPM 3种培养基，培养基分别添加1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，将处理好的杜仲种子，每瓶接种6粒，不同培养基接种10瓶。20d后调查杜仲种子萌发率。杜仲种子接种7d后，种子开始萌发出芽。15d后长出完整植株，在不同的培养基上种子出芽率不同(表1)。在20d时调查萌发率以低盐B5最高，高盐MS最低。
表1不同培养基对杜仲种子萌发的影响
不同激素对杜仲种子萌发的影响
采用B5培养基为基础培养基，培养基中分别添加1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L NAA、1.0mg/L 2,4-D、1.0mg/L KT、0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA五种不同激素。将杜仲种子消毒处理后，接种至不同培养基中，每瓶接种5粒，不同培养基接种5瓶。20d后调查杜仲种子的萌发率。接种7d后，观察到种子开始萌发出芽。15d后长出完整植株，在不同的培养基上种子的出芽率不同(表2)。在20d的调查萌发率以6-BA+NAA最高，KT相对低。
表2不同激素对杜仲种子萌发的影响
不同激素对诱导杜仲愈伤组织生长的影响
在杜仲种子萌发的基础上，取无菌苗，将幼茎切成0.7cm左右的小段，叶片切成0.5cm×0.5cm方块并在外植体上给予伤口进行接种。采用B5培养基和杜仲无菌苗幼茎、幼叶2种外植体，分别加入1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA、1.0mg/L IBA、0.5mg/L 2,4-D、1.0mg/L KT四种不同激素。进行不同激素对愈伤组织诱导率的影响的研究。每瓶接种无菌苗外植体5块。每个外植体每种激素接种10瓶，茎段、叶片20d分别调查愈伤组织诱导率。
幼叶接种7d后幼茎膨胀、叶两端开始发皱，逐渐在主脉处长出乳白色愈伤组织，15d时较粗的茎段表面出现许多纵裂，初出现愈伤组织均呈乳白色。叶片叶缘已有米粒大乳白色愈伤组织长出，以叶脉处最明显(见图1)。随培养基时间的延长，在不同激素的培养基上愈伤组织出现不同颜色，20d后4种生长素处理的外植体出愈率、愈伤组织的生长情况和颜色已有明显的差别(表3)。激素KT中的外植体长出根、芽并开始枯萎，激素IBA中极少的愈伤组织失去光泽而干枯死亡。经仔细观察不同激素的培养基对杜仲无菌苗外植体愈伤组织的诱导率激素NAA和2,4-D较好，IBA较低，KT的诱导率为0。再将愈伤组织接种到适合愈伤培育的B5+6-BA+NAA或2,4-D液体培养基或中培育悬浮细胞(图2)，每7d更新一次培养基，获取悬浮细胞。
表3不同激素对诱导杜仲愈伤组织生长的影响
信号分子与非信号分子诱导后悬浮细胞中相关酶活性检测
取6组等量的生长状态良好的悬浮细胞(已用无菌水洗去原培养基)，都加入适量新鲜2,4-D培养液，分别加入水杨酸(信号分子)SA(水杨酸的浓度控制为200μM/L)、茉莉酸甲酯MeJA(信号分子)(茉莉酸甲酯的浓度控制为200μM/L)、真菌多糖(非信号分子)(真菌多糖添加量为80mg/L)，真菌多糖(真菌多糖添加量为40mg/L)和水杨酸(水杨酸浓度控制为100μM/L)混合物，真菌多糖(真菌多糖添加量为40mg/L)和茉莉酸甲酯(茉莉酸甲酯浓度控制为100μM/L)混合物，空白对照加等量的无菌水。诱导48h后，取出，采用离心，加无菌水漂洗后再离心的方式，用无菌水反复冲洗数次，洗去植物细胞表面的培养基后，进行下一步胞内POD酶活力测定实验。取悬浮细胞材料0.1g，剪碎，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，残渣再用5mL磷酸缓冲液提取一次，低温下过滤，上清液即为粗酶液，定容至10mL刻度，贮于低温下备用。
取2支试管，于1只中加入反应混合液(反应混合液的配制：取100mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)50mL于烧杯中，加入愈创木酚28μL，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30％过氧化氢19μL，混合均匀，保存于冰箱中备用)3mL和磷酸盐缓冲液1mL，作为对照，另1支中加入反应混合液3mL和待测液1mL。迅速将两支试管中溶液混匀后，倒入比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470nm处测定吸光度(OD)值，每隔10s读数一次，并记录吸光度值，供记录4min。
以每分钟OD变化值(ΔA470/g.min)表示酶活性大小，也可以用每分钟OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位(U)表示。
过氧化物酶活性(U/g·min-1)＝ΔA470×VT/(W×VS×0.01×t)式中：
ΔA470——反应时间内OD变化值。
VT——提取酶液总体积(mL)。
W——植物鲜重(g)。
VS——测定时取用酶液体积(mL)。
t——反应时间(min)。
六个不同实验处理组杜仲细胞悬浮细胞内POD酶活OD值，结果如下图3所示。
由图中曲线斜率可知，以真菌多糖和茉莉酸甲酯混合物组的POD酶活力最高，单个物质相比，真菌多糖诱导组的POD酶活力较高，其次为空白对照组，再次为水杨酸处理组，最差为茉莉酸甲酯处理组。根据实验数据，计算得空白对照组、水杨酸诱导组、茉莉酸甲酯诱导组、真菌多糖诱导组的悬浮细胞胞内过氧化物酶活性分别为812.31、594.45、180.57、895.69(U/g·min-1)，真菌多糖和水杨酸混合物组，真菌多糖和茉莉酸甲酯混合物组的悬浮细胞胞内过氧化物酶活性分别为876.66、918.83(U/g·min-1)。
实验结果表明，真菌多糖对杜仲悬浮细胞的生长具有促进作用。与空白对照相比，水杨酸诱导组和茉莉酸甲酯诱导组的悬浮细胞过氧化物酶活力较小，两者都具有一定的抑制作用，茉莉酸甲酯在早期能诱导产生过氧化物酶，在后期具有一定的抑制作用。
将真菌多糖和水杨酸或者茉莉酸甲酯组合后，相对于无菌水，两者都具有诱导产生过氧化物酶的效果，这可能主要是因为真菌多糖诱导的原因。真菌多糖和茉莉酸甲酯组合后，其诱导能力和2倍量的真菌多糖相当，其可能的原因为，真菌多糖和茉莉酸甲酯的协同作用，通过外源刺激和内在信号转导响应共同促进酶活性的改变。
实施例3
诱导前后悬浮细胞的代谢产物检测
采用UPLC-Q-TOF/MS方法，对四个处理组的杜仲悬浮细胞进行代谢产物检测。
样品处理：取6个处理组的悬浮细胞各0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％质量浓度甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)40min，放冷，再称定重量，用50％质量浓度甲醇补足减失的重量，过滤，取续滤液，注入UPLC-Q-TOF/MS中进行检测。
HPLC检测条件：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(2.1×100mm，3.5μm)，柱温30℃，检测波长210nm，进样量4μL，流速0.3mL·min-1，流动相为乙腈(A)-0.01％甲酸溶液(B)；梯度洗脱程序见下表4。
表4梯度洗脱程序表
MS检测条件：采用ESI源，正离子模式扫描，扫描范围m/z 100-1100。参数：GasTemp:350℃、Drying Gas:6mL·min-1，Nebulizer:60psi，Sheath Gas Temp:350℃，SheathGas Flow:12mL·min-1，VCap:4000V，Skimmer:65V，Fragmentor:130V，Collision Energy:5V、10V。见图4。
结合质谱图谱，从不同处理组的杜仲悬浮细胞中共识别出8个共有化合物，对8个共有峰的质谱结果分析发现，主要有两种电离形式[M+H]+和[M+Na]+，并计算各主要成分的元素组成，通过化合物的分析比对，进行初步鉴定，8个化合物分别为缬氨酸(1)、亮氨酸(2)、苯丙氨酸(3)、色氨酸(4)、2-羟基苯乙酸(5)、牛蒡子苷(6)、柚皮苷(7)、橙皮苷(8)。
通过提取此8个特征离子图，并对EIC图进行积分，对比不同处理组样品中各特征离子EIC图峰面积(见图5)，发现化合物1、6、7、8在真菌多糖诱导处理组悬浮细胞中含量较高，化合物3、4、5在茉莉酸甲酯诱导处理组样品中含量较高，化合物2在空白对照组样品中含量较高，化合物1、5、6、7、8在真菌多糖和水杨酸组，以及在真菌多糖和茉莉酸甲酯组悬浮细胞中较高，但是在真菌多糖和茉莉酸甲酯组诱导处理组悬浮细胞中含量更高，推测在水杨酸诱导条件下，氨基酸类化合物的次生代谢积累较多；在真菌多糖诱导条件下，黄酮和木脂素类化合物的含量较高，真菌多糖和水杨酸组或茉莉酸甲酯配合，可以诱导产生化合物1、5、6、7、8，具有提高有效成分含量的作用。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本申请中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本申请中一个或多个实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本申请中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
