具体实施方式

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为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

下面实施例中所使用的实验操作方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的仪器、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下通过具体实施方式对本发明作进一步地解释说明。

表1本发明所涉及引物序列

实施例1:基于甘油作为木糖代谢“响应开关”的机制研究

为探究甘油在解脂耶氏酵母代谢木糖过程中的调控机制，将含有空质粒PYLXP’的解脂耶氏酵母po1f培养于含有亮氨酸缺陷型木糖发酵培养基(木糖40g/L，YNB1.7g/L，硫酸铵1.1g/L，CSM-Leu 0.69g/L，其余为水)的250mL摇瓶中，同时添加3‰纯甘油，30℃，250rmp/min，培养至对数生长期时提取菌体，qPCR测定未添加甘油的空白对照组和添加甘油的实验组中解脂耶氏酵母胞内木糖还原酶基因yl.xyl1、木糖醇脱氢酶基因yl.xyl2、木酮糖激酶基因yl.xyl3的表达量。

选择β肌动蛋白作为内参基因，测定这三种基因的mRNA相对表达量。测定结果见图2，显示相比于空白对照组，实验组中yl.xyl1基因表达量提高了9.8倍，yl.xyl2基因表达量提高了7.6倍，yl.xyl3基因表达量5.2倍。

同时，测定未添加甘油的空白对照组和添加甘油的实验组中菌体的生长情况，结果显示，未添加甘油的空白组菌体不生长，不消耗木糖，添加甘油的实验组菌株OD₆₀₀达到10-12，木糖消耗量为6-7g/L。

上述结果证明了甘油可作为“响应开关”激活解脂耶氏酵母的木糖代谢途径，提高菌株代谢木糖的能力。

实施例2：利用木糖产三乙酸内酯合成途径的构建

为进一步增强解脂耶氏酵母代谢木糖生产高价值化学品三乙酸内酯的能力，向解脂耶氏酵母po1f中导入优化的2-吡喃酮合成酶基因gh2ps、木糖还原酶基因yl.xyl1、木糖醇脱氢酶基因yl.xyl2、木酮糖激酶基因yl.xyl3表达盒，得到解脂耶氏酵母重组菌株Yali01，基因序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。

(1)质粒构建

所述优化的gh2ps基因由公司合成，yl.xyl1、yl.xyl2、yl.xyl3均来自解脂耶氏酵母po1f基因组。分别以gh2ps-F/gh2ps-R、yl.xyl1-F/yl.xyl1-R、yl.xyl2-F/yl.xyl2-R、yl.xyl3-F/yl.xyl3-R为引物扩增得到优化的核苷酸序列gh2ps(SEQ ID NO.1)、yl.xyl1(SEQ ID NO.2)、yl.xyl2(SEQ ID NO.3)yl.xyl3基因(SEQ ID NO.4)。PYLXP’载体骨架带有亮氨酸筛选标记和氨苄青霉素抗性基因，将扩增得到的四个基因片段连至表达载体PYLXP’上，得到含有gh2ps、yl.xyl1、yl.xyl2、yl.xyl3四个目的基因的表达盒。

(2)解脂耶氏酵母转化

采用“醋酸锂/单链DNA/PEG4000”化学转化法将含有gh2ps、yl.xyl1、yl.xyl2、yl.xyl3四个目的基因的表达盒转至宿主解脂耶氏酵母中，得到解脂耶氏酵母重组菌株Yali01。

1)酵母感受态细胞的制备：

①活化菌种。-80℃保存的菌种在固体YPD培养基上划线，30℃培养1天。

②挑取酵母单菌落在固体YPD培养基上划线传代，30℃培养1天。

③在超净台中将90μL 50％PEG4000、5μL 2mol/L醋酸锂、5μL鲑鱼精(95℃煮沸5min)

加至1.5mL干净无菌离心管中，旋涡震荡15s，混匀，制成100μL混合体系。

④刮取适量YPD平板上解脂酵母菌落接至混合体系中，旋涡震荡15s混匀，制备酵母感受态细胞

2)酵母转化

①在超净台中往制得的酵母感受态细胞中加入8μL目的质粒，旋涡震荡混匀；

②将转化体系置于30℃水浴锅中水浴，每隔10min取出来震荡15s，共4次，再转到39℃水浴锅中水浴10min；

③在超净台中加入92μL无菌水至转化体系中，震荡15s混匀，制得200μL体系；

④将以上200μL混合液涂布至亮氨酸缺陷型筛选平板上，30℃培养3天。

3)解脂耶氏酵母转化子发酵验证

从转化平板上挑取若干酵母转化子接至3mL亮氨酸缺陷型种子培养基中(木糖40g/L，YNB1.7g/L，硫酸铵5g/L，CSM-Leu0.69g/L，其余为水。)，培养2-3天，待其OD₆₀₀值长至12左右时按2％接种量接至含有10mL亮氨酸缺陷型发酵培养基(40g/L木糖，1.7g/L YNB，1.1g/L硫酸铵，0.69g/L CSM-LEU，3g/L甘油，其余为水)的50mL摇瓶中，30℃，250rpm培养5天。收集发酵液，分析生物量、TAL产量。测定结果见图3，选择三乙酸内酯产量最高的重组菌株5#(命名为Yali01)做后续发酵。

实施例3：解脂耶氏酵母重组菌株Yali01发酵生产三乙酸内酯

(1)重组菌培养

首先将实施例2中得到的重组菌Yali01接至含有3mL亮氨酸缺陷型种子培养基(木糖20g/L；YNB1.7g/L；硫酸铵5g/L；CSM-Leu0.69g/L，其余为水。)的试管中，在30℃，250rpm的摇床中培养2-3天，按2％接种量接种至含有30mL亮氨酸缺陷型发酵培养基的250mL三角瓶中，在摇床里培养7天，摇床条件设置为30℃，250rpm，每隔24h取样分析。

发酵培养基各组分及含量如下：40g/L木糖，1.7g/L YNB，1.1g/L硫酸铵，0.69g/LCSM-LEU，3g/L甘油，其余为水。

(2)发酵液检测

使用酶标仪或紫外分光光度计测定发酵液OD₆₀₀值。根据校准曲线换算成干细胞重量(DCW)，监测细胞生长；使用高效液相色谱法测定三乙酸内酯产量、残糖含量。

(3)结果

未表达2-吡喃酮合成酶基因gh2ps解脂耶氏酵母宿主不能合成三乙酸内酯，导入2-吡喃酮合成酶基因gh2ps，过表达解脂酵母内源性木糖还原酶基因yl.xyl1、木糖醇脱氢酶基因yl.xyl2、木酮糖激酶基因yl.xyl3表达盒得到重组菌Yali01，以木糖为唯一碳源，摇瓶发酵生产得到1.2g/L三乙酸内酯，发酵结果如图4所示，实现了解脂耶氏酵母以木糖为唯一碳源发酵生产三乙酸内酯，为解脂耶氏酵母利用木糖生产乙酰辅酶A衍生物奠定了基础。

实施例4：利用木糖产三乙酸内酯解脂耶氏酵母整合菌株构建

为了获得一株能够稳定利用木糖高效生产三乙酸内酯的解脂耶氏酵母工程菌，将在实验中已经证明有利于菌株生长及发酵的基因gh2ps、yl.xyl1、yl.xyl2、yl.xyl3整合至解脂酵母基因组中，构建能够直接利用木糖产三乙酸内酯的解脂酵母整合菌株Yali02。

1)质粒构建

将实施例1中的四个基因gh2ps、yl.xyl1、yl.xyl2、yl.xyl3连到整合载体pΔleu2loxP(pΔleu2loxP质粒构建方法见：Coupling metabolic addiction with negativeautoregulation to improve strain stability and pathway yield.MetabolicEngineering 61(2020)79–88)上，得到含有gh2ps、yl.xyl1、yl.xyl2、yl.xyl3的整合质粒，基因序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。Avr II，Not I双酶切整合质粒，纯化回收线性化的整合片段leu△up-ura3-gh2ps-yl.xyl3-yl.xyl2-yl.xyl1-leu△down。

2)同源重组整合

将整合片段leu△up-ura3-gh2ps-yl.xyl3-yl.xyl2-yl.xyl1-leu△down转化至解脂耶氏酵母po1f中并涂布于URA3缺陷型筛选平板上，只有整合成功的菌株能够在URA3缺陷型筛选平板上生长。将URA3平板上生长的若干阳性菌落挑至营养丰富的YPD平板中，传代培养3-5代，然后将YPD平板上长的单菌落挑至URA3缺陷型木糖筛选平板中，能够在该筛选平板上生长的单菌落为整合成功的菌株，从而达到筛选整合成功的解脂酵母菌的目的。提取酵母基因组，PCR验证基因是否整合成功，电泳结果如图5所示，整合成功菌株命名为Yali02。

实施例5：整合菌株Yali02利用木糖发酵生产三乙酸内酯

将整合菌株Yali02种子液按2％接种量接至含有30mL YPX发酵培养基的250mL摇瓶中进行曲线发酵，30℃，250rpm。每隔24h取样分析生物量、三乙酸内酯产量、木糖含量，分析方法与实施例3相同，发酵曲线如图6所示，在未优化发酵条件时整合菌株Yali02能够积累1.8g/L三乙酸内酯，为进一步降低生产成本提供了重要参考。

YPX培养基成分为：木糖40g/L，Tryptone 20g/L，Yeast Extract 10g/L，3g/L甘油，其余为水，pH约为6.0，发酵过程不控制。

实施例6：优化发酵培养基提升整合菌株Yali02的三乙酸内酯产量

为进一步提高三乙酸内酯的产量，在发酵初始添加终浓度0.2M的PBS，使用PBS缓冲液控制发酵过程pH值在6.0以上，在发酵24h时添加浅蓝菌素(脂肪酸合成酶抑制剂，抑制副产物脂肪酸合成)使其终浓度为1.5mg/L，发酵72h时，若pH降至6.0以下则添加少量氢氧化钠。评价pH值调控和副产物抑制对三乙酸内酯积累的影响。

具体的发酵方法和培养基同实施例5所述，同时设置不添加甘油的培养基作为对照，每隔24h取样分析，分析方法与实施例3相同。

同时添加浅蓝菌素和pH缓冲液时，与实施例5未添加浅蓝菌素和pH缓冲液时比，TAL产量提高172％，达到4.9g/L(发酵曲线如图7a所示)，说明在发酵过程中浅蓝菌素和PBS缓冲液对TAL产量有较大的促进作用。

同时添加浅蓝菌素和pH缓冲液以及甘油的实验组，相较只添加浅蓝菌素和pH缓冲液而未添加甘油的对照组(4.42g/L，图7b)，TAL产量提高10.9％。

本发明所用0.2M的PBS(pH6.0)配方如下(100ml)：0.2M NaH₂PO₄ 87.7ml、0.2MNa₂HPO₄ 12.3ml。

实施例7：整合菌株Yali02利用木质纤维素水解液发酵生产三乙酸内酯

将整合菌株Yali02接至含有30mL木质纤维素发酵培养基的250mL摇瓶中进行曲线发酵，30℃，250rpm，发酵初始添加PBS缓冲液使其终浓度0.2mol/L，发酵24h时添加终浓度1.5mg/L的浅蓝菌素和PBS，发酵72h时，若pH降至6.0以下则添加少量氢氧化钠。

同时，测定培养基中未添加甘油的空白对照组和添加甘油的实验组中菌体发酵情况，每隔24h取样分析生物量、三乙酸内酯产量，分析方法与实施例3相同。如图8所示未添加甘油的对照组三乙酸内酯产量2.8g/L，而如图9所示添加甘油的实验组能够积累3.1g/L三乙酸内酯，为进一步开发廉价碳源生产高价值三乙酸内酯奠定了基础。

木质纤维素水解液培养基成分为：玉米秸秆水解液30mL,Tryptone 20g/L,YeastExtract 10g/L，3‰甘油，其余为水，pH7.0左右；

玉米秸秆水解液的制备方法：

收集玉米秸秆，将其粉碎过80目筛网后得到残渣粉，将残渣粉与2％的稀硫酸溶液按照固液比1:10混合，置于高压反应釜中，经100℃高温水解100min后得到废渣与水解液的混合物，真空抽滤2-3次，除去废渣即得玉米秸秆水解液。

以上是本发明公开和提出的技术方案，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。本领域技术人员在遵循本发明的原理基础上，还可以对本发明进行诸多改善和修改，这些改进和润色也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京化工大学

<120> 一种利用木糖产三乙酸内酯的解脂耶氏酵母工程菌及应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1209

<212> DNA

<213> 非洲雏菊（Gerbera hybrida）

<400> 1

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<213> 解耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica) po1f

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 解耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica) po1f

<400> 4

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