一种快速选育天麻蜜环菌的方法
技术领域
本发明涉及药食用菌菌种选育
技术领域
，尤其涉及一种天麻伴生菌蜜环菌的快速选育方法。背景技术
天麻是一种无根无绿色叶片的兰科植物，其为传统名贵中药材之一，具有相当长的食用历史，可作为保健食品的原料；中药材种植可充分利用林下资源或者荒山野岭等资源，做到不与粮争地、争肥等，可生产附加值高的产品。
以重庆石柱林下仿野生种植天麻为例，其种植模式正逐步推广，鲜天麻质量上乘，深受市场的青睐；天麻的人工栽培依赖于萌发菌和蜜环菌的辅助，促进天麻种子的萌发和天麻生长，特别是蜜环菌是天麻必不可少的伴生菌，主要为天麻提供营养物质和促进天麻素的合成，因此蜜环菌菌种的质量与天麻的产量和质量息息相关。天麻在连续无性栽培时会发生天麻减产、质量的降低，其原因主要包括天麻种麻、萌发菌、蜜环菌的退化，其中蜜环菌退化影响更为显著。
由于目前蜜环菌的繁殖主要采用无性繁殖，多次无性繁殖退化的蜜环菌主要表现为适应性、抗逆性降低，菌索生长缓慢；继而出现菌索无弹性、易碎，甚至变成空壳。随着转接代数不断增加，蜜环菌在菌材上形成又粗、又长、多而分枝的棕黑色菌索网。蜜环菌种的获得主要通过野外优势菌株的分离和室内的选育，但是目前蜜环菌优良菌株的选育主要采用外观生长指标如生长速率、分枝数量、粗壮程度、伴栽天麻的产量和质量等作为参考，在伴栽前的选育尚未将天麻素合成的指标作为参考指标。如现有技术(杨海旭.秦巴山区天麻共生蜜环菌遗传多样性研究及优良菌种的选育[D].陕西理工学院,2016.)记载了其采用18株蜜环菌与天麻进行伴栽试验，结果显示，天麻无性繁殖阶段，ZY-17与红、乌天麻组合的天麻产量最高，其次为ZY-9，天麻有性繁殖阶段ZY-9与红天麻组合的天麻产量最高、ZY-17与乌天麻组合的天麻产量最高，该现有技术是用天麻产量来评价蜜环菌。
目前需要通过大量的对比栽培实验才可筛选出优良的蜜环菌菌株，导致工作量大，周期长，由于缺乏天麻素合成评价的外在指标参考，可能导致忽略了天麻素合成较高的菌株，为此，本发明提出一种快速选育天麻蜜环菌菌种的方法。
发明内容
本发明为了解决蜜环菌传统育种方法效率低，特别是缺乏对蜜环菌伴栽天麻的天麻素合成的外在评价指标的问题，建立一种蜜环菌天麻素合成的外在评价指标的数学模型，用于快速选育天麻蜜环菌，定向筛选天麻素合成量高的菌株，提高选育效率，减少对比栽培筛选工作量，缩短育种周期，具有良好的实用性。
本发明的技术方案为：
一种快速选育天麻蜜环菌的方法，包括以下步骤：
(1)构建蜜环菌伴栽天麻的天麻素合成的外在评价指标的数学模型；
(2)测定待测蜜环菌的天麻素合成的外在评价指标，预测该蜜环菌菌种伴栽天麻时天麻中的天麻素含量；
(3)根据步骤(2)中预测的天麻素含量，选择蜜环菌目标菌株。具体的，在外观指标均符合要求的情况下，淘汰天麻素含量预测值低的，或者选择外观指标符合要求且天麻素含量预测值高的。
该方法填补了目前没有蜜环菌菌种合成天麻素的外在评价指标的空白，在现有的选育基础上可提高蜜环菌定向筛选效率，为蜜环菌的菌种选育和菌种质量的判断提供一种方法。
在进一步的方案中，构建蜜环菌伴栽天麻的天麻素合成的外在评价指标的数学模型具体为：分离来源于同一原始菌株、不同传代次数的蜜环菌，测定蜜环菌菌株将对羟基苯甲醇的转化为天麻素的量，以及同一蜜环菌的伴栽天麻的天麻素含量，然后以生物转化合成天麻素的量为横坐标，伴栽天麻的天麻素含量为纵坐标，构建蜜环菌生物转化合成天麻素的量和伴栽天麻的天麻素含量的数学模型。所述蜜环菌生物转化合成天麻素的量为蜜环菌菌株将对羟基苯甲醇的转化为天麻素的量。
在进一步的方案中，分离蜜环菌的操作如下：从蜜环菌菌索顶端0.5cm处进行分离。同一蜜环菌选取5株以上分离菌株。
在进一步的方案中，蜜环菌体外生物转化的条件为：初始pH4.5，转化液体30mL，蜜环菌静息细胞量6.5g，对羟基苯甲醇3mg/ml，1.5％吐温80，3％葡萄糖，28℃，培养6d。
所述转化液体具体为水。
在进一步的方案中，蜜环菌静息细胞培养条件为：PDA培养基上23℃培养活化4～6天，将1mL菌悬液体加入到30mL PDA液体培养基，23℃，120rmp培养4天，10000rmp，4℃离心15min弃掉上清，无菌水洗涤2次，收集菌体静息细胞。
在进一步的方案中，天麻素的定量分析采用RP-HPLC法；waterssymmetry C18反相柱(4.6mm×150mm，5um)，流动相：0.02％磷酸溶液pH＝2.6，甲醇体积比为5:95，检测波长220nm，流速0.5ml/min，柱温35℃。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种定向快速筛选天麻伴生菌蜜环菌菌种的方法，其只需要对菌株建立天麻素合成的外在评价指标的数学关联模型，然后测定菌株外在的生物转化天麻素的含量，根据数学模型就可以预测伴栽天麻的天麻素含量，解决了优良蜜环菌的定向筛选周期长的难题，操作方便，筛选周期段，实用性强，适合推广应用。
本发明首次建立了天麻素合成的外在评价的数学模型，提高了菌种选育的效率，填补了蜜环菌天麻素高产菌株定向筛选的空白，可有效提高菌株选育效率，缩短选育的时间，同时可用于检测蜜环菌的菌种质量，为天麻的生产提供优质菌种。
本发明通过蜜环菌的外在生物转化合成天麻素的检测，预测天麻素的含量，可有效剔除退化、老化菌种，无需通过漫长的栽培对比实验，可有效缩短选育时间，在实际的生产中具有良好的价值。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。
实施例1天麻蜜环菌的快速选育
材料与设备：
蜜环菌原始菌株采自重庆市石柱县洗新乡，是目前石柱天麻栽培的主要蜜环菌菌种，也是当地天麻栽培的优良菌株，但是在使用中也存在退化。
培养箱为上海一恒的250L人工气候箱，摇床为赛默飞solaris2000，采用HPLC测定天麻素的含量。
将来自同一原始菌株、传代1～5次后的蜜环菌菌株接种至PDA培养基上培养，然后将PDA培养基上的蜜环菌用PDA液体培养基制备为菌悬液，接种至PDA的液体培养基内，培养4d，然后收集菌丝，以初始pH4.5、转化液体30mL、蜜环菌静息细胞量6.5g、对羟基苯甲醇3mg/mL、1.5％吐温80、3％葡萄糖、28℃的条件培养6d，然后采用HPLC法测定天麻素的含量，该天麻素的含量即为蜜环菌生物合成天麻素的含量。每个菌株每次3个重复，记录平均值。
从上述蜜环菌菌株中选取5株生物合成天麻素的含量有差异的菌株，进行林下仿野生抚育伴栽天麻。采收天麻后测定天麻的质量和天麻素含量。
表1蜜环菌外在生物合成天麻素的含量和伴栽天麻的产量和天麻素含量
数据的处理及数学模型的构建：以蜜环菌生物合成天麻素的量为自变量，该蜜环菌伴栽的天麻中天麻素的含量为因变量，采用excel软件进行线性回归分析，建立天麻素含量与外在生物合成天麻素的回归方程：Y＝0.0857X-0.0271，R2＝0.988。
伴栽天麻的天麻素的预测：根据建立的数学模型，从传代1～5次后的蜜环菌菌株中任选一支菌株，测定该蜜环菌生物合成天麻素的量为4.87mg/L，根据上述模型得到Y＝0.3904。取该菌株伴栽的天麻进行测定，其天麻素的含量为0.3944％。由此可以得出，回归方程预测的天麻中天麻素的量与实际测定的天麻素含量一致。
对传代5次以上明显退化的菌株，取蜜环菌菌索尖端0.5cm，切成2mm的小段，去掉菌索皮层留下菌髓，用1％的氨水诱变处理2分钟，获得诱变的复壮菌株，选取5株测定蜜环菌生物合成天麻素的量，预测伴栽天麻的天麻素含量，并测定栽培的天麻中天麻素含量，结果如表2。
表2蜜环菌复壮菌株生物合成天麻素含量和伴栽天麻素的含量
传统的蜜环菌选育无法预测伴栽天麻中天麻素的含量，只能通过天麻栽培对比实验后，取天麻并测定天麻素含量才可评价菌株对天麻素合成的影响。上述结果显示，根据蜜环菌外在生物合成天麻素的量，计算出伴栽天麻的天麻素含量与实际伴栽天麻素的含量一致，证明该发明方法是准确可靠的。传统的选育的对比栽培实验耗时近3年，周期长，并且筛选的菌株可能天麻素合成量较低。结合本发明的定向筛选可有效提高筛选的效率，证明该发明办法可快速用于菌种的定向选育，其实用强，可推广。
根据实施例1的结果，本发明方法可用于蜜环菌菌种选育的定向筛选，在现有蜜环菌菌种筛选基础上，增加天麻素生物合成的外在评价指标，用于定向筛选，预测伴栽天麻的含量，可有效提高筛选的效率，减少资源浪费，缩短筛选周期。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。
