本发明属于医药技术领域,具体涉及一种7β-甲氧基头孢美唑的分离纯化方法。该分离纯化方法经过二次分离纯化,包括步骤如下:1)样品溶解;2)第一次分离纯化;3)第二次分离纯化;4)浓缩和冻干,得到目标产物7β-甲氧基头孢美唑,其中,两次分离纯化色谱柱均选用十八烷基硅烷键合硅胶填料,流动相为TFA水溶液和乙腈,当流动相平衡系统后,进行等度洗脱,分段收集目标组分。本发明方法成功地从头孢美唑异构体混合物中分离得到7β-甲氧基头孢美唑,纯度高达98%,重现性好,便于操作。该杂质对于头孢美唑的质量研究具有重要意义,为其杂质研究提供了优质的对照品,以便于更好的控制药物质量。