本发明属于药物技术领域,具体涉及一种头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的分离纯化方法。该分离纯化方法包括步骤:1)以7-氨基-7-甲氧基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲酯为原料合成头孢米诺溶液,利用旋转蒸发仪除去大部分溶剂,得到含有头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的粘稠状液体;2)用制备液相色谱进行分离纯化,根据色谱图收集头孢米诺7β-甲氧基立体异构体对应的洗脱流分,进行预冻后,放入真空冻干机中进行冻干,即得目标产物。本发明通过制备液相色谱分离纯化,经冷冻干燥得到白色粉末状头孢米诺异构体纯品。本发明得到的头孢米诺7β-甲氧基异构体质量好、纯度高,液相纯度在98%以上。