一种分离内耳fzd10阳性胶质细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞分离和纯化领域，具体涉及一种分离内耳Frizzled10 （FZD10）阳性胶质细胞的方法。
背景技术
耳聋是全球性的重大公共卫生问题，全球大约有5亿人患有残疾性听力损失障碍，占世界总人口的6.5%，并存在上升趋势。其中感音神经性聋患者占比约65%。感音神经性耳聋是指发生病变的部位位于耳蜗及其之后的听觉通路，主要由耳蜗毛细胞和螺旋神经元蜕变造成。不同于外耳道或者中耳病变所引起的传导性聋，相当一部分感音神经性聋往往是永久性的且较难逆转。当前对于感音神经性聋的治疗主要采用人工耳蜗移植的方式。人工耳蜗通过直接对内耳中的神经元产生电刺激从而发挥治疗听力损失的作用，因此人工耳蜗的治疗效果很大程度上依赖于内耳中存活的螺旋神经元的数量和质量。近年来对于螺旋神经元的保护和再生的研究十分火热。
耳蜗中存在着一类在发育上与神经元有共同起源的胶质细胞，包括施旺细胞和卫星细胞两类，研究发现这类细胞具有自我增殖能力并且能够在体外培养和体内情况下转化为神经元。因此从内耳组织中获取纯化的耳蜗胶质细胞从而研究胶质细胞的增殖及向神经元的分化过程对于内耳再生研究具有重大意义。
然而由于耳蜗的解剖结构较为复杂以及研究技术的限制，当前仍然缺乏对于耳蜗胶质细胞的分离纯化的方法说明。胶质细胞分离纯化的第一步是耳蜗蜗轴的消化分离，在之前的大多数文献中，对于内耳中蜗轴的消化方法的介绍并不完善，例如对于消化用酶的种类，浓度，消化条件，细胞吹打方式等的描述不够详尽(Petitpre et al., 2018)。Sun etal.等人在对于蜗轴的消化过程中，采用两步消化法，每步消化时间长达30min，且所采用的的试剂种类较多，过程繁琐。
此外，在针对胶质细胞的纯化方面，之前的研究中只能分离全部的蜗轴细胞，并研究其向神经元的分化。然而蜗轴中的细胞包括神经元，胶质细胞，成纤维细胞等多种细胞类型，这使得对于胶质细胞增殖及分化特性的研究较为困难。有研究者利用神经元不能增殖传代的特性，通过先进行三代以上的成球培养以去除分离的蜗轴细胞中的神经元，然而由于一代成球就需要4到6天时间，这种方法较大的延长了实验时间，并一定程度上降低了胶质细胞的活性。此外由于内耳中的成纤维细胞同样具有增殖能力，因此这种方法并不能很好的去除蜗轴的成纤维细胞(McLean, McLean, Eatock, & Edge, 2016)。
因此当前急需一种简便而快速的分离纯化内耳胶质细胞的方法来满足对于内耳胶质细胞研究的需要。胶质细胞难以分离纯化主要是两方面原因，一是内耳解剖结构复杂：胶质细胞位于内耳的蜗轴内。内耳位于颞骨岩部，包括复杂而精密的双层迷路结构：外层骨迷路和内层膜迷路。耳蜗位于内耳迷路的前部，为两圈半的螺旋结构。骨性蜗轴位于耳蜗膜迷路正中央，呈圆锥形。蜗轴上环绕骨螺旋板，从蜗底向蜗顶呈螺旋状上升并延伸进入骨性蜗管。因此耳蜗蜗轴位置深入，骨质坚硬，其解剖有一定的技术难度。另一方面，在蜗轴中神经元、胶质细胞以及成纤维细胞等都是紧密伴生的，常规分离、消化蜗轴组织后得到的是以上多种细胞的混合物，不是只有胶质细胞。耳蜗中的胶质细胞包括施旺细胞和卫星细胞两种。众多的施旺细胞紧密贴附在神经元的突起上形成髓鞘结构，使得所有的神经纤维都被髓鞘包裹。而卫星细胞分布于神经元的胞体周围，包绕着神经元的胞体。因此，不可能直接分离耳蜗后得到纯的胶质细胞。
发明内容
针对现有技术问题，本申请利用转基因鼠杂交使得内耳中的FZD10阳性胶质细胞获得荧光标记，从而便于后续通过流式分选获取纯化的内耳胶质细胞。本发明所采用的分离纯化技术能够最大限度的获取胶质细胞并保持细胞的活性，分选后FZD10阳性胶质细胞纯度达到98%以上，能够满足后续实验的需要，且分析纯化过程简洁快速，非常适用于后续实验研究。
本申请一种分离内耳FZD10阳性胶质细胞的方法的具体技术方案包括如下步骤：
（1）取出生后第2至4天龄的FZD10-creER+/-/Rosa26R-tdTomato+/-双阳性乳鼠，消毒后置于生物安全柜操作，解剖出耳蜗，去除蜗壳暴露耳蜗内部结构后，撕去外围的螺旋韧带并去除柯蒂氏器，将剩余蜗轴部分转移到含有在4℃冰箱预冷的Hanks液的离心管中，然后1000-1500rpm离心5-10分钟，优选1500rpm离心5分钟。离心转速过高会导致细胞损伤，离心转速降低则所需离心时间延长，会导致细胞沉降不彻底而影响细胞获取量，并且会延迟实验时间而影响细胞活性。
优选的，解剖出耳蜗具体操作为：取20只左右的乳鼠去头并从颅骨正中矢状劈开，去除脑实质，剪下耳蜗所在的双侧颞骨，迅速放入盛有冷Hanks液的培养皿中，于解剖显微镜下小心解剖出耳蜗。解剖时间尽量控制在40分钟以内。
（2）步骤（1）离心结束后弃去上清Hanks液，加入酶解液，置于37℃细胞培养箱中消化7至15分钟，期间每隔两分钟轻弹离心管底部以使耳蜗组织与酶解液接触更加充分，加入等体积含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，1500rpm离心5分钟。
优选的消化时间为10分钟。
所述的酶解液组成为：1mL 酶解液中包含10 Kunits的DNAse、1mg -5mg的胶原酶、余量的Hanks液；最佳胶原酶含量为3 mg。
酶解液用量为：大约20只小鼠耳蜗加入1ml酶解液。
（3）步骤（2）离心结束后弃去上清，加入新鲜培养液，持离心管倾斜30度，采用微量移液器轻轻吹打并尽量避免引入气泡，吹打90-120下，至肉眼看不到成团组织。
所述的新鲜培养液组成为：DMEM/F12培养基中加入N2（10 μL/mL）、B27（20 μL/mL）、氨苄青霉素（1 μL/mL），使用之前加入人碱性成纤维生长因子（hBFGF，10 ng/mL）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1，50 ng /mL）、上皮细胞生长因子（EGF，20 ng /mL）、硫酸乙酰肝素（HS，50 ng /mL）。
具体的吹打操作为：将1mL微量移液器调至900μL，将枪尖伸入液体底部，轻轻吹打并尽量避免引入气泡，吹打约100下，至肉眼看不到成团组织。
（4）将细胞悬液过40μm细胞滤器去除少量未离散完全的细胞团，收集单细胞悬液并进行流式分选，分离得到FZD10阳性胶质细胞。
具体的流式分选过程为：
1）流式分选前对环境进行紫外消杀，上机分选过程严格按无菌技术操作；
2）首先在鞘液筒中加入75%乙醇对鞘液筒进行洗涤除菌，在进样管中加入1 mL75%乙醇并放置在上样架上，运行20分钟，取下含有75%乙醇的上样管，换成含有1 mL无菌PBS的上样管继续运行两次，以清洗干净管道中残留的75%乙醇；
3）将单细胞悬液稀释为1000个/μL浓度以提高分选得率，含有单细胞悬液的上样管置于上样口，在收集管接口处放置两只含有10 mL培养基的15 mL离心管以分别收集FZD10阳性和FZD10阴性细胞；
4）分选过程中使用70μm喷嘴，调整流速为5000 events/s，使用561nm的黄绿激光进行目标分选。分选过程大约需要30分钟。
用该方法分离出的FZD10阳性胶质细胞为纯化的耳蜗FZD10阳性胶质细胞，其中胶质细胞数占总细胞数95%以上，且细胞接种成活率较高，可用于后续培养及听力学研究。
本申请中所采用的FZD10-creER+/-/Rosa26R-tdTomato+/-双阳性P3期乳鼠可采用本领域现有常规技术获得，具体可以采用以下方法：
（1）将cre酶的编码基因及雌激素受体（estrogen receptor）基因插入到frizzled10的启动子下构建条件性转基因小鼠模型FZD10-creERT2杂合小鼠；
（2）利用FZD10-creERT2杂合小鼠与Rosa26R-tdTomato纯合小鼠杂交，后代小鼠全部发育正常，获得双阳性的FZD10-creER+/-/Rosa26R-tdTomato+/-小鼠；
（3）以每克小鼠给予0.75mg 他莫昔芬（tamoxifen）的比例进行灌胃，根据cre-loxp系统的作用原理，在FZD10阳性细胞中cre重组酶会被激活而切除loxp位点间的停止码，使FZD10阳性细胞及其子细胞被红色荧光蛋白tomato标记。
采用1 mL含有浓度为1-5 mg/ mL的胶原酶以及10 Kunits/mL的DNAse的Hanks溶液作为酶解液为本发明的独创。常规的细胞分离使用0.25%的胰酶（实施例4）进行消化，使用胰酶消化组织细胞得率低，且对细胞活性损伤更大。本申请中1 mL含有浓度为1-5mg/ mL的胶原酶以及10 Kunits/mL的DNAse的Hanks溶液进行消化，该浓度的胶原酶（尤其是3mg/mL的胶原酶）可以较为温和的对蜗轴组织进行消化且细胞得率较高，组织在胶原酶消化分散的过程中，未降解的组织成分会形成胶状物粘连细胞，影响细胞的分散，而 DNase的加入能够分解此类物质，使粘连的细胞分散。
将解剖的蜗轴放入该溶液后置于37℃细胞培养箱（Heal Force，HF240）中消化7-15分钟（优选10分钟），期间每隔两分钟轻弹离心管底部以使耳蜗组织与酶解液接触更加充分。该消化时间及相关操作为本发明的重要步骤，虽然看似为简单操作，但消化是分离过程中的重要步骤，若时间过短消化不充分，时间过长将对耳蜗细胞造成损伤。
消化完成后，持离心管倾斜30度，将1mL微量移液器调至900μL容量，枪头伸入液体底部后轻轻吹打，并尽量避免引入气泡。吹打大约100下，至肉眼看不到成团组织。该操作为获取离散单细胞的关键步骤。其中吹打过程中1 mL移液器调至900μL容量后进行吹打，是避免引入气泡的操作关键点。吹打次数为100次左右，低于90次组织无法充分离散，超过120次则会严重损伤细胞活性。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
I．本发明所采用的组织消化和吹打方法能够最大限度的消化、离散组织并获取单细胞悬液，同时避免了对耳蜗组织细胞活性造成严重损伤。
II．实验过程操作简便，消化耳蜗组织所需试剂仅包括胶原酶、DNAse、Hanks液以及含血清培养基，解剖出耳蜗组织后获取单细胞悬液的过程按照消化-终止消化-离心-吹打四步进行，在时间上尽量缩短了实验流程，上述实验步骤可控制在20min时间内，最大限度的保证了细胞活性。
III．分选后的细胞为纯化的耳蜗FZD10阳性胶质细胞，免疫染色证实胶质细胞占比达98%以上，几乎不含神经元或者成纤维细胞等其它耳蜗细胞类型。由于去除了其它细胞类型，利用获得的纯化FZD10阳性胶质细胞可以开展后续精准的听力学研究。
附图说明
图1为实施例1中蜗轴消化为单细胞后流式分选前后接种细胞代表图以及流式分选后接种细胞代表图；
图2为实施例1中流式分选后对细胞进行不同荧光染色对比图；
其中：
图1中，标号1为流式分选前光镜视野；标号2为流式分选前荧光镜视野；标号3为流式分选后光镜视野；标号4流式分选后荧光镜视野，流式分选前后观察的视野中细胞总数基本一致，可见，蜗轴经酶解消化并吹打为单细胞后过40μm细胞滤器，接种后可见蜗轴组织被消化为单细胞，标号1和2视野图说明流式分选前 tomato阳性细胞只占蜗轴细胞数的极少比例；标号3和4视野图说明流式分选后获得的细胞中98%以上的细胞都是tomato标记的FZD10阳性细胞。
图2中，从左到右依次为：
DAPI：被DAPI标记细胞核的所有细胞；
Tomato：被免疫荧光蛋白tomato标记的FZD10阳性细胞；
FZD10：加入FZD10的抗体标记FZD10的阳性细胞；
Merge：前三幅图DAPI, Tomato, FZD10的合并图；
由此可见分选后所获得的tomato阳性细胞中98%以上的细胞都表现为FZD10的染色阳性，证实流式分选后获得了纯化的胶质细胞群。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。除特殊说明外，以下实施例中均采用常规技术操作完成。
以下实施例几对比例中的FZD10-creER+/-/Rosa26R-tdTomato+/-双阳性P3期乳鼠均采用以下方法获得：
（1）将cre酶的编码基因及雌激素受体（estrogen receptor）基因插入到frizzled10的启动子下构建条件性转基因小鼠模型FZD10-creERT2杂合小鼠；
（2）利用FZD10-creERT2杂合小鼠与Rosa26R-tdTomato纯合小鼠杂交，后代小鼠全部发育正常，获得双阳性的FZD10-creER+/-/Rosa26R-tdTomato+/-小鼠；
（3）以每克小鼠注射0.75 mg他莫昔芬（tamoxifen）的比例灌胃tamoxifen，根据cre-loxp系统的作用原理，在FZD10阳性细胞中cre重组酶会被激活而切除loxp位点间的停止码，使FZD10阳性细胞及其子细胞被红色荧光蛋白tomato标记。
各实施例及对比例中具体的流式分选过程为：
流式分选步骤及参数
1）流式分选前半小时对流式分选房间环境进行紫外照射，上机分选过程严格按无菌技术操作。
2）首先在鞘液筒中加入75%乙醇对鞘液筒进行洗涤除菌，在进样管中加入1 mL75%乙醇并放置在上样架上，运行20分钟，取下含有75%乙醇的上样管，换成含有1 mL无菌PBS的上样管继续运行两次，以清洗干净管道中残留的75%乙醇。
3）将单细胞悬液稀释为1000个/μL浓度以提高分选得率。含有单细胞悬液的上样管置于上样口，在收集管接口处放置两只含有10 mL培养基的15 mL离心管以分别收集FZD10阳性和FZD10阴性细胞。
4）分选过程中使用70μm喷嘴，调整流速为5000 events/s，使用561nm的黄绿激光进行目标分选。分选过程大约需要30分钟。
以下实施例中：
生物安全柜，来源Thermo Fisher Scientific,型号1300；
Hanks液，来源Solarbio，型号H1045；
胶原酶，来源Sigma，型号C5138；
DNAse，来源Stem Cell Technologies，型号07473；
10%FBS，来源Ausbian，型号VS500T；
DMEM/F12培养基，来源gibco；
B27，来源invitrogen，型号17504044；
N2来源invitrogen，型号17502048；
氨苄青霉素，来源Solarbio，型号A7490；
人碱性成纤维生长因子，来源Sigma，型号F0291；
胰岛素样生长因子-1，来源Sigma，型号I8779；
上皮细胞生长因子，来源Sigma，型号E9644；
硫酸乙酰肝素，来源Sigma，型号H4777；
胰酶-EDTA，来源Gibco，型号25200072；
FZD10抗体，来源proteintech，型号18175-1-AP；
DAPI，来源Thermo Fisher Scientific，型号D1306；
层黏连蛋白，来源Merck，型号L2020；
细胞滤器，来源Falcon，型号352340；
流式细胞分选仪，来源BD，型号FACSAriaⅢ；
细胞培养箱，来源Heal Force，型号HF240。
实施例1
（1）取20只出生后3天龄的FZD10-creER+/-/Rosa26R-tdTomato+/-双阳性乳鼠，酒精喷洒消毒后置于生物安全柜操作，乳鼠去头并从颅骨正中矢状劈开，去除脑实质，剪下耳蜗所在的双侧颞骨，迅速放入盛有冷Hanks液的培养皿中，于解剖显微镜下小心解剖出耳蜗，去除蜗壳暴露耳蜗内部结构后，小心撕去外围的螺旋韧带并去除柯蒂氏器，剩余蜗轴部分转移到含有冷的Hanks液的15毫升离心管中。将含有蜗轴组织的15mL离心管放入离心机中以1500rpm的转速离心5分钟。
（2）事先配制消化蜗轴所需的酶解液：1mL酶解液中含有10 Kunits的DNAse以及3mg的胶原酶，余量为Hanks液。离心结束后弃去上清Hanks液，加入1 mL酶解液，置于37℃细胞培养箱中消化10分钟，期间每隔两分钟轻弹离心管底部以使耳蜗组织与酶解液接触更加充分，加入等体积含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，1500rpm离心5分钟。
（3）步骤（2）离心结束后弃去上清，加入新鲜培养液，左手持15mL离心管倾斜30度，1mL微量移液器调至900μL,将枪尖伸入液体底部，轻轻吹打并尽量避免引入气泡。吹打100下，至肉眼看不到成团组织。
所述新鲜培养液为：DMEM/F12培养基中加入N2（10 μL/mL）、B27（20 μL/mL）、氨苄青霉素（1 μL/mL），使用之前加入人碱性成纤维生长因子（hBFGF，10 ng/mL）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1，50 ng /mL）、上皮细胞生长因子（EGF，20 ng /mL）、硫酸乙酰肝素（HS，50 ng/mL）。
（4）将细胞悬液过40μm细胞滤器以去除少量未离散完全的细胞团，收集单细胞悬液并立刻进行流式分选。
利用该消化及分离单细胞方法分离得到的蜗轴单细胞总数为200万个，分选后获取到的FZD10阳性细胞数为7万个。
流式分选后细胞培养及鉴定：
1）以50个/μL浓度将FZD10阳性细胞接种于层粘连蛋白包被的48孔培养板中（将层粘连蛋白以1:500比例溶解于PBS中进行包被），每孔接种200 μL即10000个细胞。将培养皿置于含有5% CO2的37℃细胞培养箱中培养24小时。
2）光镜下计数贴壁细胞数量并计算细胞贴壁成活率；使用细胞计数及免疫荧光染色计算FZD10阳性胶质细胞率。
培养结束后，光镜下计数培养板各孔中的贴壁细胞数量为7890—8350个，平均8047个, 因此，本次培养细胞贴壁成活率为8047/10000*100%=80.47%。
免疫荧光染色使用一抗为抗-FZD10抗体，加入相应二抗及DAPI孵育，封片后使用共聚焦显微镜观察，并分别计数每个培养孔中FZD10阳性细胞数和DAPI阳性细胞数。本次每孔中FZD10阳性细胞数为7050-7960，平均7487，DAPI阳性细胞数为7210-8100，平均7637，因此，本次培养的细胞FZD10阳性胶质细胞率为7487/7637*100%=98.04%。
利用该方法分离出的FZD10阳性胶质细胞为纯化的耳蜗FZD10阳性胶质细胞，其中FZD10阳性胶质细胞数占总细胞数98 .04%，且细胞贴壁成活率达到80.47%，可用于后续培养及听力学研究。
实施例2
（1）取20只出生后两天的FZD10-creER+/-/Rosa26R-tdTomato+/-双阳性乳鼠，酒精喷洒消毒后置于生物安全柜操作，乳鼠去头并从颅骨正中矢状劈开，去除脑实质，剪下耳蜗所在的双侧颞骨，迅速放入盛有冷Hanks液的培养皿中，于解剖显微镜下小心解剖出耳蜗，去除蜗壳暴露耳蜗内部结构后，小心撕去外围的螺旋韧带并去除柯蒂氏器，剩余蜗轴部分转移到含有冷的Hanks液的15毫升离心管中。将含有蜗轴组织的15mL离心管放入离心机中以1500rpm的转速离心5分钟。
（2）事先配制消化蜗轴所需的酶解液：1mL酶解液中含有10 Kunits的DNAse以及1mg的胶原酶，余量为Hanks液。离心结束后弃去上清Hanks液，加入1 mL酶解液，置于37℃细胞培养箱中消化15分钟，期间每隔两分钟轻弹离心管底部以使耳蜗组织与酶解液接触更加充分，加入等体积含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，1000rpm离心10分钟。
（3）步骤（2）离心结束后弃去上清，加入新鲜培养液，左手持15mL离心管倾斜30度，1mL微量移液器调至900μL,将枪尖伸入液体底部，轻轻吹打并尽量避免引入气泡。吹打120下，至肉眼看不到成团组织。
所述新鲜培养液为： DMEM/F12培养基中加入N2（10 μL/mL）、B27（20 μL/mL）、氨苄青霉素（1 μL/mL），使用之前加入人碱性成纤维生长因子（hBFGF，10 ng/mL）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1，50 ng /mL）、上皮细胞生长因子（EGF，20 ng /mL）、硫酸乙酰肝素（HS，50 ng/mL）。
（4）将细胞悬液过40μm细胞滤器以去除少量未离散完全的细胞团，收集单细胞悬液并立刻进行流式分选。
利用该消化及分离单细胞方法分离得到的蜗轴单细胞总数为150万个，分选后获取到的FZD10阳性细胞数为5万个。
流式分选后细胞培养及鉴定：
1）以50个/μL浓度将FZD10阳性细胞接种于层粘连蛋白包被的48孔培养板中（将层粘连蛋白以1:500比例溶解于PBS中进行包被），每孔接种200 μL即10000个细胞。将培养皿置于含有5% CO2的37℃细胞培养箱中培养24小时。
2）光镜下计数贴壁细胞数量并计算细胞贴壁成活率；使用细胞计数及免疫荧光染色计算FZD10阳性胶质细胞率。
培养结束后，光镜下计数培养板各孔中的贴壁细胞数量为6200—7600个，平均7037个, 因此，本次培养细胞贴壁成活率为7037/10000*100%=70.37%。
免疫荧光染色使用一抗为抗-FZD10抗体，加入相应二抗及DAPI孵育，封片后使用共聚焦显微镜观察，并分别计数每个培养孔中FZD10阳性细胞数和DAPI阳性细胞数。本次每孔中FZD10阳性细胞数为5450-6830，平均6290，DAPI阳性细胞数为5620-6900，平均6423，因此，本次培养的细胞FZD10阳性胶质细胞率为6290/6423*100%=97.92 %。
利用该方法分离出的FZD10阳性胶质细胞为纯化的耳蜗FZD10阳性胶质细胞，其中FZD10阳性胶质细胞数占总细胞数97.92%，细胞贴壁成活率为70.37%。
实施例3
（1）取20只出生后三天的FZD10-creER+/-/Rosa26R-tdTomato+/-双阳性乳鼠，酒精喷洒消毒后置于生物安全柜操作，乳鼠去头并从颅骨正中矢状劈开，去除脑实质，剪下耳蜗所在的双侧颞骨，迅速放入盛有冷Hanks液的培养皿中，于解剖显微镜下小心解剖出耳蜗，去除蜗壳暴露耳蜗内部结构后，小心撕去外围的螺旋韧带并去除柯蒂氏器，剩余蜗轴部分转移到含有冷的Hanks液的15毫升离心管中。将含有蜗轴组织的15mL离心管放入离心机中以1500rpm的转速离心5分钟。
（2）事先配制消化蜗轴所需的酶解液：1mL酶解液中含有10 Kunits的DNAse以及5mg的胶原酶，余量为Hanks液。离心结束后弃去上清Hanks液，加入1 mL酶解液，置于37℃细胞培养箱中消化7分钟，期间每隔两分钟轻弹离心管底部以使耳蜗组织与酶解液接触更加充分，加入等体积含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，1500rpm离心5分钟。
（3）步骤（2）离心结束后弃去上清，加入新鲜培养液，左手持15mL离心管倾斜30度，1mL微量移液器调至900μL,将枪尖伸入液体底部，轻轻吹打并尽量避免引入气泡。吹打90下，至肉眼看不到成团组织。
所述新鲜培养液为：DMEM/F12培养基中加入N2（10 μL/mL）、B27（20 μL/mL）、氨苄青霉素（1 μL/mL），使用之前加入人碱性成纤维生长因子（hBFGF，10 ng/mL）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1，50 ng /mL）、上皮细胞生长因子（EGF，20 ng /mL）、硫酸乙酰肝素（HS，50 ng/mL）。
（4）将细胞悬液过40μm细胞滤器以去除少量未离散完全的细胞团，收集单细胞悬液并立刻进行流式分选。
利用该消化及分离单细胞方法分离得到的蜗轴单细胞总数为200万个，分选后获取到的FZD10阳性细胞数为7万个。
流式分选后细胞培养及鉴定：
1）以50个/μL浓度将FZD10阳性细胞接种于层粘连蛋白包被的48孔培养板中（将层粘连蛋白以1:500比例溶解于PBS中进行包被），每孔接种200 μL即10000个细胞。将培养皿置于含有5% CO2的37℃细胞培养箱中培养24小时。
2）光镜下计数贴壁细胞数量并计算细胞贴壁成活率；使用细胞计数及免疫荧光染色计算FZD10阳性胶质细胞率。
培养结束后，光镜下计数培养板各孔中的贴壁细胞数量为5500—6400个，平均5933个, 因此，本次培养细胞贴壁成活率为5933/10000*100%=59.33%。
免疫荧光染色使用一抗为抗-FZD10抗体，加入相应二抗及DAPI孵育，封片后使用共聚焦显微镜观察，并分别计数每个培养孔中FZD10阳性细胞数和DAPI阳性细胞数。本次每孔中FZD10阳性细胞数为4740-6030，平均5427，DAPI阳性细胞数为4850-6130，平均5543，因此，本次培养的细胞FZD10阳性胶质细胞率为5427/5543*100%=97.90 %。
利用该方法分离出的FZD10阳性胶质细胞为纯化的耳蜗FZD10阳性胶质细胞，其中FZD10阳性胶质细胞数占总细胞数97.90%，细胞贴壁成活率为59.33%。
对比例1
（1）取20只出生后三天的FZD10-creER+/-/Rosa26R-tdTomato+/-双阳性乳鼠，酒精喷洒消毒后置于生物安全柜操作，乳鼠去头并从颅骨正中矢状劈开，去除脑实质，剪下耳蜗所在的双侧颞骨，迅速放入盛有冷Hanks液的培养皿中，于解剖显微镜下小心解剖出耳蜗，去除蜗壳暴露耳蜗内部结构后，小心撕去外围的螺旋韧带并去除柯蒂氏器，剩余蜗轴部分转移到含有冷的Hanks液的15毫升离心管中。将含有蜗轴组织的15mL离心管放入离心机中以1500rpm的转速离心5分钟。
（2）离心结束后弃去上清Hanks液，加入1 mL酶解液，置于37℃细胞培养箱中消化10分钟，期间每隔两分钟轻弹离心管底部以使耳蜗组织与酶解液接触更加充分，加入等体积含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，1500rpm离心5分钟。
所述酶解液组成为：1mL酶解液中含有10 Kunits的DNAse以及0.25%的胰酶-EDTA，余量为Hanks液。
（3）步骤（2）离心结束后弃去上清，加入新鲜培养液，左手持15mL离心管倾斜30度，1mL微量移液器调至900μL,将枪尖伸入液体底部，轻轻吹打并尽量避免引入气泡。吹打100下，至肉眼看不到成团组织。所述新鲜培养液为：DMEM/F12培养基中加入N2（10 μL/mL）、B27（20 μL/mL）、氨苄青霉素（1 μL/mL），使用之前加入人碱性成纤维生长因子（hBFGF，10 ng/mL）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1，50 ng /mL）、上皮细胞生长因子（EGF，20 ng /mL）、硫酸乙酰肝素（HS，50 ng /mL））。
（4）将细胞悬液过40μm细胞滤器以去除少量未离散完全的细胞团，收集单细胞悬液并立刻进行流式分选。
利用该消化及分离单细胞方法分离得到的蜗轴单细胞总数为150万个，分选后获取到的FZD10阳性细胞数为5万个。
流式分选后细胞培养及鉴定：
1）以50个/μL浓度将FZD10阳性细胞接种于层粘连蛋白包被的48孔培养板中（将层粘连蛋白以1:500比例溶解于PBS中进行包被），每孔接种200 μL即10000个细胞。将培养皿置于含有5% CO2的37℃细胞培养箱中培养24小时。
2）光镜下计数贴壁细胞数量并计算细胞贴壁成活率；使用细胞计数及免疫荧光染色计算FZD10阳性胶质细胞率。
培养结束后，光镜下计数培养板各孔中的贴壁细胞数量为4830—5250个，平均5096个, 因此，本次培养细胞贴壁成活率为5096/10000*100%=50.96%。
免疫荧光染色使用一抗为抗-FZD10抗体，加入相应二抗及DAPI孵育，封片后使用共聚焦显微镜观察，并分别计数每个培养孔中FZD10阳性细胞数和DAPI阳性细胞数。本次每孔中FZD10阳性细胞数为4630-4980，平均4830，DAPI阳性细胞数为4700-5100，平均4937，因此，本次培养的细胞FZD10阳性胶质细胞率为4830/4937*100%=97.84 %。
利用该方法分离出的FZD10阳性胶质细胞为纯化的耳蜗FZD10阳性胶质细胞，其中FZD10阳性胶质细胞数占总细胞数97.84%，细胞贴壁成活率只有50.96%。
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