一种特异性靶向癌种的新抗原制备方法
技术领域
本发明涉及抗原制备方法
技术领域
，具体领域为一种特异性靶向癌种的新抗原制备方法。背景技术
肿瘤是威胁人类生命的重大疾病，目前我国乃至全世界，每年新增癌症患者不断增加，传统的治疗方法均有较大的局限性。现在的手术只能切除可见的肿瘤及周围的可见淋巴结，不能实现彻底清除肿瘤细胞，不能改变患者体内失衡环境；放化疗可以杀死部分肿瘤细胞，但一部分实体肿瘤对放化疗不敏感，放化疗的副作用给患者的免疫系统带来负面影响，无法阻止肿瘤的复发转移；现有的分子靶向药物应用范围局限性大，易产生耐药性。因此，需开辟新的精准的治疗途径和手段。
研究表明，重建/恢复患者自身抗击肿瘤免疫系统功能是治疗肿瘤策略之一。近年来肿瘤免疫已成为抗肿瘤治疗的第四大手段，肿瘤免疫治疗的成功需要满足四个重点要素：1)佳的靶向肿瘤抗原；2)能正确诱导和扩增免疫细胞的平台；3)切断免疫抑制机制；4)促进肿瘤特异性细胞毒T(CTL)浸润到肿瘤组织中去。而最佳的抗原是保证肿瘤特异性免疫治疗精准靶向性的关键。
DC细胞全称树突状细胞，是近年来倍受人们关注的专职抗原呈递细胞，能摄取、加工及呈递抗原，启动T细胞介导的免疫反应。DC细胞有多种的来源途径，最便捷的是取外周血分离获取单个核细胞。由于DC细胞和CTL细胞扩增较为困难，为满足治疗所需要的细胞数，通常在培养起始的细胞数量上采取相对应的措施：1)在采集细胞前3-5天注射GM-CSF进行骨髓细胞动员，增加外周血单个核细胞的比例；2)白细胞分离机，通过外周血循环血液来采集大量的单个核细胞。上述处理事实上对患者的骨髓和外周血进行很强的外来干预，尤其是对癌症患者术后、放疗、化疗后紊乱的免疫系统的机体内环境进一步造成很大的干扰。为此提出一种对机体干扰性小，及较少的起始细胞数量开始，经过培养和抗原活化后，在细胞数量和表型均能达高标准的特异性靶向癌种的新抗原制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性靶向癌种的新抗原制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种特异性靶向癌种的新抗原制备方法，其制备方法包括如下步骤：
1)分析制备精准靶向肿瘤抗原；
2)采集、分离培养DC细胞；
3)采用精准靶向肿瘤抗原及激活剂制备敏活化DC细胞；
4)封闭DC细胞表面分子，收获DC细胞疫苗。
优选的，步骤2)中采集、分离培养DC细胞方法如下：
C)外周血分离单个核细胞：从静脉抽取抗凝血缓慢加在细胞分离液上，离心分离单个核细胞，1-5×107个/ml；
B)DC细胞的分离、诱导及扩增：细胞用DC细胞培养液重悬后，在条件为37℃、5％浓度CO2孵箱中贴壁2-5h，吸出未贴壁的悬浮细胞用于肿瘤抗原致敏DC活化的细胞毒T细胞，贴壁细胞即为DC细胞前体；向DC细胞前体中加入专用DC细胞培养基、加入终浓度500-1000IU的rh-IL-4和终浓度500-1000IU的rh-GM-CSF，孵育箱条件为37℃、5％浓度CO2孵育诱导扩增7-10天，获得未成熟DC细胞有待活化，根据细胞状态补加DC细胞培养基及因子。
优选的，步骤3)采用精准靶向肿瘤抗原及激活剂制备敏活化DC细胞的方法如下：
采用自身血清分析制备的精准靶向肿瘤抗原，同时加入激活剂，孵育后得到致敏活化DC细胞，其中激活剂为免疫球蛋白，单克隆抗体，分子化合物，核酸产物；
所制备的精准靶向肿瘤抗原致敏活化的DC细胞表面表达CD80，CD83，CD86，HLA-DR。
体外诱导靶向肿瘤特异性细胞毒T细胞：在DC细胞收获当天，第二次抽取同一位肿瘤患者抗凝血40-60ml，分离单个核细胞贴壁培养，吸取未贴壁单个核细胞，与当天收获的抗原致敏活化的DC细胞以4-8:1比例混合，置培养瓶内加入CTL专用培养液启动培养，孵育箱条件为37℃、5％浓度CO2孵育培养，次日加入CD3单抗，CD28单抗，rh-IL-2继续培养，根据细胞生长扩增状态，个体化适量补充含有rh-IL-2CTL培养液进行CTL细胞的扩增培养。
优选的，继步骤3后，CTL细胞培养至第12-16日时，达到细胞对数生长高峰期，收获CTL细胞前，加入封闭单克隆抗体1-10ug/ml，封闭CTL细胞表面的分子，孵育箱条件为37℃、5％浓度CO2孵育1-3h，收集细胞悬液离心并洗涤2次，留取质控样品，进行活细胞计数，所得CTL细胞用100ml生理盐水重悬，加入人血清白蛋白，备静脉滴注所用。
优选的，步骤1)的分析制备精准靶向肿瘤抗原与步骤2)的外周血出自同一个体。
优选的，步骤1)所述精准靶向肿瘤抗原类型选自肿瘤特异性多肽、基于基因测序和生物学信息分析，预测制备精准靶向肿瘤抗原。
优选的，步骤1)所述精准靶向肿瘤抗原通过患者分离出的血清，进行基因检测得到全基因谱，利用生物学信息分析找出肿瘤高表达基因段，生物合成复合精准靶向肿瘤特异性抗原。
本发明的有益效果是：利用较少起始数量的外周血单个核细胞来制备精准靶向肿瘤抗原，在体外有效地诱导，扩增精准靶向肿瘤特异性细胞毒T细胞(CTL)，作为肿瘤患者的临床治疗，对机体干扰性小。所获得的DC细胞疫苗，有效解决了肿瘤抗原免疫原性不强，靶点不全不清晰，患者的肿瘤抗原不易获得等相关制备方面问题；本制备方法有效解决DC细胞和细胞毒T(CTL)体外扩增不足的问题，DC细胞和细胞毒T(CTL)体外培养中激活的免疫检测点的封闭问题；本制备方法能够有效地在体外和体内诱导精准靶向肿瘤抗原特异性细胞毒T(CTL)，并具备对肿瘤高效的特异性杀伤功能。
附图说明
图1为本发明实施例中DC细胞占比；
图2为本发明实施例中DC细胞表面CD80表达情况；
图3为本发明实施例中DC细胞表面CD83表达情况；
图4为本发明实施例中DC细胞表面CD86表达情况；
图5为本发明实施例中DC细胞表面HLA-DR表达情况；
图6为本发明实施例中CTL细胞占比；
图7为本发明实施例中CTL细胞CD3表达情况；
图8为本发明实施例中CTL细胞CD3里CD4的占比；
图9为本发明实施例中CTL细胞CD3里CD8的占比。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
抗原制备：
取患者术中切除的肿瘤组织及正常组织，分别将肿瘤组织与正常组织进行DNA序列比对，鉴定出肿瘤细胞特有的体细胞突变；
根据突变信息预测可能存在于细胞中的特异性抗原，同时对比结果预测患者自身HLA分型；
根据HLA能够结合的肽段长度8-11个氨基酸序列，截取含有突变氨基酸的肽序列，利用亲和力预测分析短肽与患者自身HLA的结合力；
根据HLA的亲和力，突变的可信度，突变频率筛选出一批突变点，此作为合成特异性肽的序列来合成肽，肽的数量范围为5-20，得到特异性靶向的抗原。
荷载靶向肿瘤抗原DC细胞疫苗的制备：
1)外周血分离单个核细胞
采集无菌外周血45ml，缓慢加入在淋巴细胞分离液上，利用梯密度离心法获得单个核细胞，吸取管中白膜层，转移至含有生理盐水的离心管中，洗涤细胞，弃掉上清，加入专用DC细胞培养基，重悬细胞计数。
2)定向诱导扩增DC细胞
单个核细胞在条件为37℃、5％浓度CO2孵育箱中贴壁h，吸出未贴壁细胞，加入rh-IL-4，rh_GM-CSF500-1000IU(终浓度)孵育箱条件为37℃、5％浓度CO2孵育，定向诱导扩增DC细胞7-10天，根据细胞生长扩增情况，适量补充含有rh-IL-4，rh-GM-CSF500-1000IU(终浓度)的专用培养基。
3)抗原致敏活化DC细胞
DC细胞培养至7-9天，采用检测合成靶向肿瘤抗原，按比例加入靶向肿瘤抗原，孵育箱条件为37℃、5％浓度CO2孵育过夜。
4)DC细胞封闭表面分子
DC细胞培养致敏至8-10天，收获DC细胞之前，加入封闭因子7ug/ml(终浓度)，孵育箱条件为37℃、5％浓度CO2孵育3h。
5)收获DC细胞
封闭DC细胞表面分子后，吸取细胞悬液，用预冷生理盐水冲洗未脱落的细胞，直至脱落，待细胞全部脱落，收集所有细胞悬液洗涤离心2次；DC细胞用1ml生理盐水重悬备用治疗。同取样品质控，检测微生物，内毒素；流式细胞术检测DC细胞表面CD80，CD83，CD86，HLA-DR表达情况。
6)靶向肿瘤抗原致敏活化的DC细胞体外诱导扩增肿瘤特异性细胞毒T(CTL)
DC细胞疫苗收获当天，二次抽取患者抗凝血40-60ml，贴壁制备DC细胞，吸取新鲜分离未贴壁单个核细胞，以8:1的比例与制备成熟的DC细胞疫苗混合，用CTL专用的启动培养基重悬，转至相应的细胞培养瓶中，孵育箱条件为37℃、5％浓度CO2孵育过夜，次日加入CD3抗体、CD28抗体、rh-IL-2，孵育箱条件为37℃、5％浓度CO2继续孵育。根据细胞生长扩增情况，适量补加含有rh-IL-2的CTL专用扩增培养液进行CTL扩增培养。
收获细胞毒T(CTL)
待CTL培养至15日，在细胞成对数生长高峰期时，收获CTL细胞前，加入封闭分子抗体1-10ug/ml(终浓度)，孵育箱条件为37℃、5％浓度CO2孵育3h。收集细胞悬液离心并洗涤2次，留取质控样品，进行活细胞计数，细胞活率达到95％以上，细胞总数1×1010左右；所得CTL细胞用100ml生理盐水重悬，加入人血清白蛋白，备人静脉滴注用。流式细胞术检测细胞表型CD3、CD8表达情况。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
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