一种扩增脐带血来源的nk细胞的培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养方法领域，具体涉及一种扩增脐带血来源的NK细胞的培养方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)作为机体主动免疫的淋巴细胞，具有天然的杀伤肿瘤细胞的能力。研究表明造血干细胞移植后首先恢复的淋巴细胞就是NK细胞，而且造血干细胞移植初期输注供者来源的NK细胞可以减少移植物抗宿主病(GVHD)的发生。脐带血中含有较高比率CD34+细胞，因此被认为是应用于临床的安全有效的干细胞来源。研究表明脐带血中含有较高比例的NK细胞，但是脐带血中的NK细胞为未成熟的NK细胞，杀伤活性较低。
现有的NK细胞的培养方法多针对源自外周血单个核细胞的NK细胞。
中国专利201380028253.3中公开了一种诱导和扩增源自外周血单个核细胞的自然杀伤细胞的方法，该方法包括：在存在细胞因子的条件下，将作为饲养细胞的经辐射的Jurkat细胞和经辐射的由EB病毒转化的连续性淋巴细胞株细胞与外周血单个核细胞进行共培养。该发明专利提供的培养方法可以从少量的外周血单个核细胞中诱导及增殖大量的NK细胞，可显著提高将所述NK细胞用于癌症时的预防和治疗的效率和效能。
中国专利201610482853.2中公开了一种扩增NK细胞的方法，该方法使用失活的LCL饲养细胞、外周血单个核细胞、细胞因子IL-2和IL-15在细胞培养液中进行细胞培养，对外周血单个核细胞中的NK细胞选择性的扩增，该发明显著提高了NK细胞的扩增效率，而且提高了NK杀伤功能，可以扩增NK细胞达600-800倍，与新鲜分离的NK细胞比较，对白血病细胞K562杀伤力提高10倍，与单纯的利用IL-2培养后的NK细胞对白血病细胞K562杀伤能力提高20％以上。
但以上方法应用于脐带血来源的NK细胞的培养时，得到的NK细胞并不能表现出优越的临床应用特征，因此，一种更适合脐带血来源的NK细胞的培养方法的建立是十分有必要的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了用灭活的LCL细胞作为滋养细胞，联合细胞因子特异性扩增脐带血来源的NK细胞，增强NK细胞的抗肿瘤活性使其更适合应用于临床治疗。
LCL：lymphoblastoid cell lines，淋巴母细胞系。
CBMC：脐带血单个核细胞。
PBMC：外周血单个核细胞。
EBV：Epstein-Barr virus，EB病毒。
一方面，本发明提供了一种高效扩增脐带血来源的NK细胞的培养方法。
所述的培养方法中包括用灭活的LCL细胞作为滋养细胞，联合细胞因子特异性扩增脐带血来源的NK细胞。
所述的NK细胞为通过培养CBMC获得。
所述的LCL细胞与CBMC的用量比为1：1-5，优选为1：1。
所述的LCL细胞为LCL-mbIL-15细胞和/或EBV-LCL细胞。
所述的EBV-LCL细胞通过使用含EBV上清液的培养基培养PBMC得到。
所述的LCL-mbIL-15细胞通过使用含EBV上清液的培养基培养PBMC，然后进一步转染mbIL-15得到。
所述的细胞因子包括但不限于IL-2，IL-15，IL-21。
优选地，所述的IL-2应用量为0-200U/mL，IL-15应用量为0-200U/mL，IL-21应用量为0-3000U/mL。
优选地，所述的IL-2应用量为100U/mL，IL-15应用量为100U/mL，IL-21应用量为2500U/mL。
优选地，所述的培养方法使用的的基础培养基为含10％胎牛血清的RPMI l640培养液。
优选地，所述的培养方法包括以下步骤：
(1)从脐带血中分离CBMC；
(2)制备EBV上清液；
(3)EBV上清液培养PBMC制备EBV-LCL细胞；
(4)质粒转染LCL细胞获得LCL-mbIL-15细胞；
(5)紫外线照射LCL-mbIL-15细胞后用于培养步骤(1)得到的CBMC。
进一步优选地，所述的紫外线照射的条件为0.120J/cm2。
另一方面，本发明提供了一种脐带血来源的NK细胞。
所述的NK细胞通过前述的培养方法制备。
再一方面，本发明提供了前述脐带血来源的NK细胞在制备免疫治疗药物中的应用。
又一方面，本发明一种免疫治疗药物。
所述的免疫治疗药物中包括前述培养方法制备的脐带血来源的NK细胞。
又一方面，本发明提供了前述培养方法在制备免疫治疗药物中的应用。
所述的免疫治疗药物中包含前述培养方法制备的NK细胞。
又一方面，本发明提供了前述培养方法在制备其他来源的NK细胞中的应用。
所述的其他来源包括但不限于外周血、淋巴结、骨髓。
本发明的有益效果：
1、采用本申请提供的方法培养的CBMC细胞扩增出的NK细胞的纯度高达85％，扩增倍数为700±50.5，抑制性受体CD158a、CD158b和NKG2A无明显变化(p>0.05)，而活化性受体包括NCKs(NKp30、NKp44、NKp46)和NKG2D的比率均有明显升高(p<0.05)。
2、本申请的方法获得的NK细胞对恶行肿瘤细胞杀伤活性明显升高。尤其刚新鲜分离未培养的CB-NK对于表达较高HLA Ⅰ类分子Raji细胞杀伤性很低，但是扩增的CB-NK细胞对Raji细胞的杀伤性明显升高。
附图说明
图1为LCL-mbIL-15细胞作为滋养细胞条件下，细胞计数CB-NK细胞用紫外线照射过LCL-mbIL-5作为滋养细胞培养21天后CB-NK细胞扩增的倍数。
图2为LCL-mbIL-15细胞作为滋养细胞条件下，流式细胞仪检测CB-NK细胞表面活化性受体和抑制性受体的表达水平(n＝11)，*表示p>0.05，**表示p<0.05。
图3为LCL-mbIL-15细胞作为滋养细胞条件下，培养前分离纯化的CB-NK细胞和培养后CB-NK细胞对不表达HLA Ⅰ类分子的白血病细胞K562杀伤作用。
图4为LCL-mbIL-15细胞作为滋养细胞条件下，培养前分离纯化的CB-NK细胞和培养后CB-NK细胞对高表达HLA Ⅰ类分子的淋巴瘤细胞Raji杀伤作用。
图5为LCL-mbIL-15细胞作为滋养细胞条件下，培养前分离纯化的CB-NK细胞和培养后CB-NK细胞的纯度变化。
图6为LCL-mbIL-15细胞作为滋养细胞条件下，培养后CB-NK细胞的抗体表达情况。
图7为LCL-mbIL-15细胞作为滋养细胞条件下，培养后CB-NK细胞的抗体表达情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1高效扩增脐带血来源的NK细胞的培养方法
步骤1、CBMC分离
抽取脐带血5mL，脐带血与PBS混合，混合比例为1：1。另取一个15mL离心管并加入5mL的淋巴细胞分离液(购自：CEDARLANE公司，货号为CL5020)。用滴管将上述脐带血和PBS的混合液沿管壁缓慢地滴至淋巴细胞分离液的液面之上，注意不要破坏分层液面。水平离心800g，20min。离心后，离心管分为3层。用吸引器吸取上、中层界面中间的白色云雾层至一新的离心管中，尽量不要带入其他层细胞。在此离心管中加入5倍以上的PBS，离心300g，5min，弃上清。重复2次，以洗去淋巴细胞分离液及细胞碎片等。末次离心后，弃上清。上述所有步骤尽可能在较短时间内完成。分离的CBMC细胞分装用细胞冻存液储存在液氮中备用。
步骤2、EBV上清液的制备
将B95-8细胞(购自中国科学院细胞库，货号为GNO3)放入含有10％胎牛血清(FBS，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号为10099141C)、50U/mL青链霉素(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号为15070063)的PRMI 1640培养液(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号为11875093)中，并在37℃、5％CO2条件下正常培养传代。培养后的B958细胞经饥饿裂解后，通过离心、过滤后收集其上清液，该上清液富含EBV。将此EBV上清液分装储存于-80℃。使用时先在37℃下复温，然后用0.22μm的滤膜过滤后使用(尽量在30-60min内完成)。
步骤3、EBV-LCL细胞的制备
向T25培养瓶中加入9mL PRMI 1640培养液，再加入2×106个PBMC；接着加入9mL步骤2制备的EBV上清液；再加入80μL环孢素A(购自Sigma，货号为239835)；在37℃下培养。7d后，对培养瓶中的液体进行半换液并加入40μL环孢素A。该过程每7d重复1次，直至培养28d为止。培养28d后，即得EBV-LCL细胞。
步骤4、NK细胞的培养
EBV-LCL细胞在培养实验前用紫外线照射0.120J/cm2。
步骤1得到的分离冻存的CBMC，经过39℃水浴箱解冻复苏后，用RPMI1640培养液洗2次，再用含10％胎牛血清的RPMI l640培养液悬浮为2×106个/mL的细胞悬浮液，然后向24孔板中每孔加入1mL细胞悬浮液。向细胞悬浮液中加入IL-2(终浓度为100U/mL)+IL-15(终浓度为100U/mL)+IL-21(终浓度为2500U/mL)，EBV-LCL(1×106个)。在37℃、5％CO2的孵育箱中培养，每隔3d对各个孔中的液体进行半换液并补充相应细胞因子，共培养14-21d。
其中，IL-2购自美国PeproTech(派普泰克)公司，货号为200-02；IL-15购自美国PeproTech(派普泰克)公司，货号为200-15；IL-21购自美国PeproTech(派普泰克)公司，货号为200-21。
步骤5、NK细胞免疫表型的检测
对扩增前后的CBMC进行流式细胞仪分析，分别用CD45、CD56、CD16、CD3抗体，对扩增培养前后的细胞进行分类鉴定，确认NK细胞的比例。同时通过流式细胞仪对扩增前后的NK细胞表面受体用CD158a、CDl58b、NKG2D、NK046、NKp30、NKp44抗体进行分析。
其中，CD45购自BD biosciences公司，货号为555484；CD56购自BD biosciences公司，货号为555518；CD16购自BD biosciences公司，货号为555407；CD3购自BD biosciences公司，货号为555339；CD158a购自BD biosciences公司，货号为556063；CDl58b购自BDbiosciences公司，货号为559785；NKG2D购自BD biosciences公司，货号为558071；NKp46购自BD biosciences公司，货号为557991；NKp30购自BD biosciences公司，货号为563385；NKp44购自BD biosciences公司，货号为558563。
具体操作方法：将扩增前后的NK细胞分别用PBS洗涤2次，然后重悬细胞。每1×105/100μL中分别加入相应的抗体4μL，在4℃条件下，避光作用30min，再用PBS洗2次，然后用300μL PBS重新悬浮该细胞，通过流式细胞仪进行检测，结果分析使用flowjo762软件。
步骤6、NK细胞杀伤能力检测
流式细胞仪检测NK细胞的杀伤作用。分离纯化的NK细胞分别培养作为效应细胞。髓系白血病细胞株K562(购自中国科学院细胞库，货号为SCSP-5054)，淋巴瘤细胞Raji(购自中国科学院细胞库，货号为TCHu 44)，预先用荧光染料CFSE(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号为C34554)孵育10min，然后用含有10％FBS的RPMI-1640洗2次后重新悬浮，并按照2×105/孔分别放入圆底U形管中作为靶细胞，按照效应细胞：靶细胞(Effector：Target，E:T)的不同比值，加入相应的培养后NK细胞，在培养箱里培养12h后再用PBS洗1次，另设空白对照组(不加效应细胞)，然后将效靶细胞混合液用PBS洗2次，然后加入PI(染色)避光孵育30min后采用流式细胞仪检测。
其中CFSE、PI双阳性的细胞即为被杀伤的靶细胞。特异性杀伤计算百分比公式(％)：[实验组死亡的靶细胞(％)-自然死亡的靶细胞(％)/100-自然死亡的靶细胞(％)]×100。
实验结果如下：
1、流式细胞仪检测培养前后脐带血的NK细胞表面受体的变化
CBMC细胞用EBV-LCL作为滋养细胞培养和扩增NK细胞21天后，用流式细胞仪检测CD3-CD56+的比率以及其细胞表面受体的变化。培养21天后超过33％的细胞为CD3-CD56+(NK)细胞，NK细胞的绝对数为培养前200±12.5倍。和培养前细胞比较，抑制性受体CD158a、CD158b和NKG2A无明显变化(p>0.05)，而活化性受体包括NCKs(NKp30、NKp44、NKp46)和NKG2D的比率均有明显升高(p<0.05)。
2.脐带血NK细胞对白血病细胞的杀伤活性
用CB-NK细胞作为效应细胞，检测对恶性肿瘤细胞K562、Raji的细胞毒性作用。和培养前的比较，CB-NK细胞的杀伤活性明显升高。尤其刚新鲜分离未培养的CB-NK对于表达较高HLA Ⅰ类分子Raji细胞杀伤性很低，但是扩增的CB-NK细胞对Raji细胞的杀伤性明显升高。
实施例2高效扩增脐带血来源的NK细胞的培养方法
参考实施例1的培养方法，区别在于滋养细胞由EVB-LCL替换为LCL-mbIL-15。
LCL-mbIL-15的制备方法如下：
(1)质粒构建
载体以Invitrogen公司出品的慢病毒载体pLenti6V5-GW-LaZ为骨架进行改造，在其3LTR插入绝缘子(IS2)(Francisco Martin,Karim Benabdellah,et al.A chimericHS4-SAR insulator(IS2)that prevents silencing and enhances expression oflentiviral vectors in pluripotent stem cells[J].PLoS ONE,2014,9(1):e84268.)，启动子采用了人源EF-1，报导基因EGFP由IRES连接。
mbIL-15PCR产物：提取人类肾癌细胞RNA反转录形成cDNA。以此cDNA为模板设计膜结合IL5基因引物，在上游引物5’端加上BamHⅠ限制性内切酶，下游引物5’端加上XbaⅠ限制性内切酶。上游引物序列见SEQ ID NO.1，下游引物序列见SEQ ID NO.2。扩增反应程序为：95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环，扩增完成后凝胶电泳鉴定。mbIL-15的序列如SEQ ID NO.3所示。PCR产物经酒精和离心沉淀后备用。
载体酶切：酶切体系包括10×buffer 5μL，DNA 5μL，BamHI和XbaI限制性内切酶各1μL，水4μL，37℃水浴3h。然后经凝胶电泳分离，并进一步采用凝胶DNA抽提试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号为DP214)纯化。
连接：纯化后的2个DNA片段由T4 DNA连接酶连接。连接体系为10μL，包括T4 DNA连接酶10×buffer 1μL，载体片段2μL，目的片段4μL，T4 DNA连接酶(购自NEB公司，货号为M0202V)1μL，14℃连接过夜。
转化：将连接产物取出加入装有感受态细菌(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号为CB101)冰水混合状态的1.5mL EP管中，冰浴30min，42℃水浴40s，冰浴3min，加入800μL LB液体培养基30℃振荡培养离心，弃上清，立即吹打混匀后加入氨苄抗性的固体培养基上，用三角形玻璃棒涂匀，平板放入37℃恒温箱中培养过夜。挑取饱满的菌落于1:1000的氨苄液体培养基中，30℃振荡培养过夜。
抽提mbIL15表达质粒：质粒抽提试剂盒来自南京诺唯赞生物公司，完成后取出样品进行酶切鉴定。
(2)病毒产生：采用特定的包装系统进行病毒包装。质粒混合液由9μg包装质粒(包括分别表达病毒载体包装所需的gap/pol、Rev、VSV-G的质粒，均来自Invitrogen)和3μgmbIL15表达质粒，以及50μL Buffer B，加纯水至500μL；上述混合液滴入等量的Buffer A，然后在室温放置30分钟。将上述溶液加入至铺有293T细胞的试剂盒培养皿中，轻轻混匀，置于37℃培养箱中培养。转染剂Transfection reagent(CPT Transfection Kit)购自武汉Viraltherapy。转染12-24小时后，更换含血清DMEM培养液，继续48-72小时培养后，收集培养液，3000g离心15分钟，去除细胞残骸，并用0.45μm滤器过滤病毒上清液。病毒用PEG-it沉淀，离心(1500g，15分钟)浓缩。病毒沉淀物溶于其10-100倍容积的DMEM培养基，分装后贮存于-80℃备用。
(3)细胞转染：LCL细胞转染在经重组人纤维连接蛋白(50μg/mL)处理的96孔板内进行。细胞悬浮于相应的细胞培养液，然后和相应容积的浓缩病毒混合，补充细胞因子，加入96孔板，并以4μg/mL的浓度加入聚凝胺(Polybrene)。将96孔板在室温离心(700-800g)2小时后，在培养箱培养过夜。病毒感染的阳性细胞通过流式细胞仪筛选。获得LCL-mbIL-15细胞。
参照实施例1的方法的第4-6步培养NK细胞，区别仅在于，步骤4替换如下：
步骤4、NK细胞的培养
LCL-mbIL-15细胞在培养实验前用紫外线照射0.120J/cm2。
步骤1得到的分离冻存的CBMC，经过39℃水浴箱解冻复苏后，用RPMI1640培养液洗2次，再用含10％胎牛血清的RPMI l640培养液悬浮为2×106个/mL的细胞悬浮液，然后向24孔板中每孔加入1mL细胞悬浮液。向细胞悬浮液中加入IL-2(终浓度为100U/mL)+IL-15(终浓度为100U/mL)+IL-21(终浓度为2500U/mL)，LCL-mbIL-15(1×106个)。在37℃、5％CO2的孵育箱中培养，每隔3d对各个孔中的液体进行半换液并补充相应细胞因子，共培养21天。
实验结果如下：
1、流式细胞仪检测培养前后脐带血的NK细胞表面受体的变化
CBMC细胞用LCL-mbIL-15作为滋养细胞培养和扩增NK细胞21天后，用流式细胞仪检测CD3-CD56+的比率以及其细胞表面受体的变化。培养21天后超过85％的细胞为CD3-CD56+(NK)细胞，NK细胞的绝对数为培养前700±10.5倍(图1)。和培养前CB-NK细胞比较，抑制性受体CD158a、CD158b和NKG2A无明显变化(p>0.05)，而活化性受体包括NCKs(NKp30、NKp44、NKp46)和NKG2D的比率均有明显升高(p<0.05)(图2)，NK细胞的纯度以及扩增效率与实施例1培养的NK细胞比较明显提高，NK细胞纯度变化如图5所示。培养后的NK细胞抗体表达情况如图6、图7所示。
2.脐带血NK细胞对白血病细胞的杀伤活性
用CB-NK细胞作为效应细胞，检测对恶性肿瘤细胞K562、Raji的细胞毒性作用。和培养前的比较，CB-NK细胞对恶性肿瘤细胞K562、Raji的杀伤活性明显升高(图3、图4)。尤其刚新鲜分离未培养的CB-NK对于表达较高HLA Ⅰ类分子Raji细胞杀伤性很低，但是扩增的CB-NK细胞对Raji细胞的杀伤性明显升高(图4)。K562杀伤活性与实施例1培养的NK细胞基本一致。
对比例
参照实施例1的方法培养NK细胞，区别在于步骤4如下：
步骤4：步骤1得到的分离冻存的CBMC，经过39℃水浴箱解冻复苏后，用RPMI1640培养液洗2次，再用含10％胎牛血清的RPMI l640培养液悬浮为2×106个/mL的细胞悬浮液，然后向24孔板中每孔加入1mL细胞悬浮液。向细胞悬浮液中加入IL-2(终浓度为100U/mL)+IL-15(终浓度为100U/mL)+IL-21(终浓度为2500U/mL)。在37℃、5％CO2的孵育箱中培养，每隔3d对各个孔中的液体进行半换液并补充相应细胞因子，共培养14-21d。
与实施例1和实施例2培养得到的的NK细胞对比，对比例培养得到的NK细胞对恶性肿瘤细胞K562的杀伤性明显降低，对Raji细胞的杀伤性明显降低。且活化性受体包括NCKs(NKp30、NKp44、NKp46)和NKG2D的比率均有明显降低。
序列表
<110> 江苏蒙彼利生物科技有限公司
<120> 一种扩增脐带血来源的NK细胞的培养方法
<130> 20200512
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgaggatcc atggccttac cagtgaccgc c 31
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgctctagat tagcagtaaa gggtgataac cagtgacagg 40
<210> 3
<211> 615
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgaactggg tgaatgtaat aagtgatttg aaaaaaattg aagatcttat tcaatctatg 120
catattgatg ctactttata tacggaaagt gatgttcacc ccagttgcaa agtaacagca 180
atgaagtgct ttctcttgga gttacaagtt atttcacttg agtccggaga tgcaagtatt 240
catgatacag tagaaaatct gatcatccta gcaaacaaca gtttgtcttc taatgggaat 300
gtaacagaat ctggatgcaa agaatgtgag gaactggagg aaaaaaatat taaagaattt 360
ttgcagagtt ttgtacatat tgtccaaatg ttcatcaaca cttctaccac gacgccagcg 420
ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 480
gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 540
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 600
accctttact gctaa 615
