一种外泌体的纯化方法
技术领域
本发明涉及外泌体制备领域，具体涉及一种外泌体的纯化方法。
背景技术
用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞或细胞内不同组分分层达到分离的目的。常用的密度梯度介质主要为蔗糖和氯化铯。外泌体是通过内体内陷形成多囊泡体后通过质膜融合向细胞外释放而形成的纳米级脂质囊泡，大小在30～150nm，密度范围通常为1.12至1.17g/mL，比DNA、RNA和大多数蛋白质轻。传统的差异超速离心是外泌体分离和纯化最常用的方法之一，但当外泌体离心到离心管底部时由于离心力的作用往往不能保证外泌体的完整性且分离纯度有限。在一些研究中，已经使用了在超速离心管中添加缓冲垫(Optiprep或Exojuice)或密度梯度介质(蔗糖或氯化铯)，来提高外泌体的纯度或保证其完整性。使用蔗糖密度梯度和氯化铯密度梯度离心达到密度梯度平衡费时且较难去除，蔗糖溶液和氯化铯溶液容易形成高的渗透压不利于外泌体完整性的维持。因此对于开发一种新的密度梯度介质，并处于安全考虑容易去除，对于高纯度外泌体的获取将是很有必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种外泌体的纯化方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种外泌体的纯化方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将富含外泌体的细胞培养液于9000～11000g离心；
(2)将步骤(1)得到的上清液和碘帕醇溶液一起离心，得到外泌体粗提液，离心时，碘帕醇位于所述步骤(1)得到的上清液下部，离心力为100000～110000g；所述碘帕醇溶液的浓度为40～42％(w/v)；步骤(1)得到的上清液和碘帕醇的体积比为500～600:1；
(3)将外泌体粗提液用缓冲溶液稀释4～6倍和外泌纯一起离心，外泌纯位于所述外泌体粗提液下部，离心力为100000～110000g；外泌体粗提液和外泌纯的体积比为2:1～1.2；所述外泌纯为25～30％(w/v)的碘帕醇溶液；
(4)分别收集步骤(3)离心分层后的产物。
上述方法通过对一定浓度的碘帕醇经过超速离心可以很快速的形成连续密度梯度，且能够用于较高纯度外泌体的分离，有利于提高获得的外泌体的纯度。
优选地，所述步骤(3)中，缓冲溶液为PBS缓冲液。
优选地，所述步骤(1)中，离心的时间为25～35min。
优选地，所述步骤(2)中，离心的时间为65～75min。
优选地，所述步骤(3)中，离心的时间为65～75min。
本发明还一种用于外泌体的纯化方法的连续密度梯度介质，所述连续密度梯度介质的制备方法包括以下步骤：将外泌纯在100000g离心力下离心70min。
上述连续密度梯度介质由上层到底层，密度逐渐连续提高，可以用于较高纯度外泌体的分离，能够提高获得的外泌体的纯度。
本发明还一种用于外泌体的纯化方法的连续密度梯度介质的制备方法，所述连续密度梯度介质的制备方法包括以下步骤：将外泌纯在100000g离心力下离心70min。
上述的制备方法获得的连续密度梯度介质由上层到底层，密度逐渐连续提高，可以用于较高纯度外泌体的分离，能够提高获得的外泌体的纯度。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种外泌体的纯化方法，本发明的纯化方法通过对一定浓度的碘帕醇经过超速离心可以很快速的形成连续密度梯度，且能够用于较高纯度外泌体的分离，有利于提高获得的外泌体的纯度。
附图说明
图1为本发明实施例的连续密度梯度介质的密度分布结果图。
图2为本发明实施例的外泌体的纯化方法流程图。
图3为本发明实施例的外泌体的纯化结果表征图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
作为本发明实施例的一种外泌体的纯化方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将50mL富含外泌体的细胞培养液于4℃和10000g离心30min；
(2)将步骤(1)得到的上清液转移至超速离心管(BECKMAN，Cat#：326823)，超速离心管底部预先加入100μL的40％(w/v)的碘帕醇溶液；100000g离心70min，得到外泌体粗提液，离心时，步骤(1)得到的上清液和碘帕醇的体积比为500:1；
(3)将1mL外泌体粗提液用PBS缓冲溶液稀释到5mL混匀，转移至一新的超速离心管(BECKMAN，Cat#：326819)内，超速离心管底部预先加入500uL外泌纯(冷冻后解冻)，100000g离心70min；所述外泌纯为25％(w/v)的碘帕醇溶液；
(4)从底部分层收取，每层100μL液体，从底部往上依次为#5、#4、#3、#2、#1共5层，收集分层样品。
富含外泌体的细胞培养液的制备方法包括以下步骤：HEK293T细胞来自中国科学院细胞研究所，利用含10％的无外泌体胎牛血清(Excell Bio)和1％青霉素/链霉素(Gibco)的DMEM培养基(Gibco)在37℃，5％CO2的恒温培养箱中培养。当细胞融合度达到90％时，收集富含外泌体的细胞培养液。
实施例2
作为本发明实施例的一种外泌体的纯化方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将50mL富含外泌体的细胞培养液于4℃和9000g离心25min；
(2)将步骤(1)得到的上清液转移至超速离心管(BECKMAN，Cat#：326823)，超速离心管底部预先加入100μL的42％(w/v)的碘帕醇溶液；110000g离心65min，得到外泌体粗提液，离心时，步骤(1)得到的上清液和碘帕醇的体积比为550:1；
(3)将1mL外泌体粗提液用PBS缓冲溶液稀释到5mL混匀，转移至一新的超速离心管(BECKMAN，Cat#：326819)内，超速离心管底部预先加入500uL外泌纯(冷冻后解冻)，100000g离心65min；所述外泌纯为28％(w/v)的碘帕醇溶液；
(4)从底部分层收取，每层100μL液体，从底部往上依次为#5、#4、#3、#2、#1共5层，收集分层样品。
实施例3
作为本发明实施例的一种外泌体的纯化方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将50mL富含外泌体的细胞培养液于4℃和11000g离心35min；
(2)将步骤(1)得到的上清液转移至超速离心管(BECKMAN，Cat#：326823)，超速离心管底部预先加入100μL的40％(w/v)的碘帕醇溶液；90000g离心75min，得到外泌体粗提液，离心时，步骤(1)得到的上清液和碘帕醇的体积比为600:1；
(3)将1mL外泌体粗提液用PBS缓冲溶液稀释到5mL混匀，转移至一新的超速离心管(BECKMAN，Cat#：326819)内，超速离心管底部预先加入600uL外泌纯(冷冻后解冻)，110000g离心75min；所述外泌纯为30％(w/v)的碘帕醇溶液；
(4)从底部分层收取，每层100μL液体，从底部往上依次为#5、#4、#3、#2、#1共5层，收集分层样品。
效果实验
1、连续密度梯度介质的制备：配制浓度为25％(w/v)的碘帕醇溶液，称为外泌纯，英文名为ExoPure，取5mL外泌纯溶液加入超速离心管(BECKMAN，Cat#：326819)内，并将其置于-20℃冰箱1h或-80℃冰箱30min。取出离心管待外泌纯溶液溶解后进行超速离心，离心条件为100000g，70min。离心结束后，分层从上往下，每200μL吸取液体进行密度测定。密度计算公式＝质量/体积。每100μL液体通过精密电子天平称量质量。获得25个连续的检测点数据。同时也改变离心条件，在冷冻、解冻后离心过夜，同样方式获取25个连续的监测点数据。结果如图1所示。共取25层(图1A)，将密度数据从上到下汇总绘图可见密度变化曲线(图1B)。
由图1可知，上述连续密度梯度介质由上层到底层，密度逐渐连续提高。
外泌纯特性分析：浓度为25％(w/v)的碘帕醇溶液，通过质量体积比计算得到密度为1.142g/mL，通过Micro-Osmometer Model 210测得渗透压为316±3mOsm/kg。与PBS渗透压相近。PBS渗透压为310±2mOsm/kg。
2、将收集到的分层样品进行粒径分析、电镜检测及WB检测外泌体标志分子。
(1)蛋白免疫印迹鉴定：取外泌体样品20μL，加5x蛋白loading buffer混匀，95℃加热10min后，冰上冷却，利用10％的SDS-PAGE蛋白胶分离，将分离胶上的蛋白转印至PVDF膜，5％的脱脂牛奶封闭1h后，孵育TSG101抗体1h，再孵育辣根过氧化物酶标记的二抗1h，最后利用ECL化学发光底物反应，在Tanon凝胶成像仪中检测荧光信号。
(2)外泌体纳米粒径分析：取外泌体样品1μL，用PBS稀释1000倍后，利用1mL一次性注射器将稀释液体缓慢注入Nanosight仪器样品槽内，利用nanosight检测和分析软件统计样品内外泌体颗粒数和大小分布。
(3)透射电镜鉴定外泌体形态：取外泌体样品10μL，加10μL 2.5％的戊二醛固定，使用1％的乙酸双氧铀复染后滴加到铜网上，在Hitachi H-7650透射电子显微镜下采集图片。
将不同分层收集的样品，从上到下依次标记为EP1、EP2、EP3、EP4、EP5，取出部分提取外泌体蛋白进行外泌体标志分子TSG101检测，发现在第三层(EP3)和第四层(EP4)有外泌体信号(图3A)，且在第四层信号最强。同时将第三层和第四层样品进行电镜检测，可以观察到第四层有囊泡样结构的外泌体(图3C)，粒径分析结果显示大小在130nm处有一峰值，且分布范围在200nm以下(图3E)，显示外泌体纯度很高。上述效果实验为实施例1验证得到的效果，实施例2-3与实施例1的效果类似，因此，不再赘述。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
