具体实施方式

针对现有技术中存在的通过病毒感染法筛选用于培养PRRSV以获得高病毒含量病毒液的Marc-145细胞株中需要向Marc-145单克隆细胞群(由单个Marc-145细胞株繁殖形成的细胞群)接种病毒而可能存在安全问题以及耗时长的缺陷，本发明旨在利用间接免疫荧光方法检测Marc-145单克隆细胞群中细胞表面出现特异性荧光的细胞(即细胞表面存在CD163受体的细胞)占细胞群的百分比，从而可以快速、方便、准确、客观筛选出能够用于培养PRRSV以获得高病毒含量(不低于10^7.0TCID₅₀/ml，甚至不低于10^8.0TCID₅₀/ml)病毒液的Marc-145细胞株，可以避免现有的病毒感染法中需要向Marc-145单克隆细胞群接种病毒而存在的潜在感染风险和耗时长的问题。

已知PRRSV入侵靶细胞与细胞表面受体密切相关，且已发现多种细胞受体和关键分子在PRRSV感染过程中发挥作用，包括CD163受体、唾液酸黏附素(Sn或CD169)、硫酸乙酰肝素(HepS)、波形蛋白(Vimentin)、CD151受体以及MYH9、CD209和Siglecs(例如Siglec-10)分子等。其中CD163受体、波形蛋白、CD151受体、MYH9和Siglecs是Marc-145细胞表面存在的主要参与PRRSV感染和入侵Marc-145细胞的受体和关键分子，均在PRRSV结合感染Marc-145细胞以及病毒内化过程中发挥重要作用，例如波形蛋白可参与PRRSV与其他细胞骨架细丝结合与介导PRRSV的细胞内转运，MYH9和CD163受体可在PRRSV感染细胞过程中共同作用促进病毒内化，CD163受体可与不同的Siglecs结合从而参与病毒入侵过程等(参见叶梦雪等人，猪繁殖与呼吸综合征病毒受体及其在病毒感染中的作用研究进展，动物医学进展，2020，41(12)：102-107，以下称文献2)。显然，使用天然Marc-145细胞体外培养增殖PRRSV获得的病毒液中的病毒含量应与Marc-145细胞表面存在的所有参与PRRSV感染和入侵Marc-145细胞的受体和关键分子的总含量密切相关，而不取决于其中一种受体或关键分子的含量，这些受体和关键分子的总含量越高，感染细胞并内化的病毒数量就可能越多，就越有可能获得高病毒含量的病毒液，并且现有技术(例如专利文献CN103525773A)已经通过基因重组方法构建能够表达这些受体和分子(例如硫酸乙酰肝素、唾液酸粘附素、波形蛋白、CD163、CD151等)中的单个或多个的Marc-145细胞来增加Marc-145细胞表面的受体和分子含量，进而提高PRRSV感染滴度。

然而，发明人在PRRSV疫苗生产过程中惊讶发现，在天然Marc-145细胞群(包括由不同的Marc-145细胞株繁殖形成的多克隆细胞群和由单株Marc-145细胞繁殖形成的单克隆细胞群)中并非本领域中普遍所认为的所有的Marc-145细胞表面都存在CD163受体(例如参见上述文献2，第106页左栏最后一段)，并且在该Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞(利用间接免疫荧光方法检测为细胞表面出现特异性亮绿色荧光的细胞)占细胞群的百分比与使用该Marc-145细胞群体外培养增殖PRRSV获得的病毒液中的病毒含量(TCID₅₀)具有直接的正相关关系，而无需考虑Marc-145细胞表面上所有参与PRRSV感染和入侵Marc-145细胞的受体和关键分子的总含量。因此，发明人认为可以通过利用间接免疫荧光方法检测Marc-145细胞群中细胞表面出现特异性荧光的细胞(即细胞表面存在CD163受体的细胞)占细胞群的百分比来表征利用该细胞群体外培养增殖PRRSV所获得的病毒液的病毒含量，进而可以利用间接免疫荧光方法检测由单株Marc-145细胞繁殖形成的单克隆细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占细胞群的百分比来筛选能够用来培养增殖PRRSV以获得高病毒含量(10^7.0TCID₅₀/ml以上，甚至达到10^8.0TCID₅₀/ml以上)病毒液的Marc-145细胞株。经验证，当Marc-145单克隆细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到50％时，利用该Marc-145单克隆细胞群体外培养增殖PRRSV获得的病毒液中病毒含量不低于10^7.0TCID₅₀/ml；当Marc-145单克隆细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到80％时，利用该Marc-145单克隆细胞群体外培养增殖PRRSV获得的病毒液中病毒含量不低于10^8.0TCID₅₀/ml，进而可以筛选出能够用来培养增殖PRRSV以获得高病毒含量病毒液的Marc-145细胞株。基于此，发明人还认为可以通过利用间接免疫荧光方法检测Marc-145细胞群(包括Marc-145多克隆细胞群(贴壁或悬浮)和Marc-145单克隆细胞群(贴壁或悬浮))中细胞表面存在CD163受体的细胞占细胞群的百分比来预测利用该细胞群体外培养增殖PRRSV所获得的病毒液中病毒的含量，进而可以用于指导PRRSV疫苗的生产。

通过以下具体实施方式详细说明本发明。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。

实施例1：间接免疫荧光方法检测Marc-145贴壁细胞CD163受体

该实施例利用间接免疫荧光方法检测Marc-145多克隆贴壁细胞群(由不同的Marc-145贴壁细胞株繁殖形成的多克隆贴壁细胞群)中细胞表面的CD163受体，并利用该多克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV，以测定所获得的病毒液中的病毒含量，具体包括以下操作。

1.1、Marc-145贴壁细胞的培养：将Marc-145贴壁细胞(金宇保灵生物药品有限公司兽用疫苗国家工程实验室保存)在细胞培养瓶中培养，生长液为含有10％(体积百分比)新生牛血清的DMEM培养基(商购)，在37℃5％CO₂的恒温培养箱中培养，2～3天传代1次，长满单层细胞。用胰酶消化后，加入生长液制成细胞悬液以3×10⁵个/ml的密度接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃5％CO₂的条件下培养，48h后细胞贴壁铺满孔底。

1.2、间接免疫荧光方法检测Marc-145贴壁细胞群中细胞表面CD163受体

(1)洗涤：弃去步骤1.1中96孔板的孔中生长液，用PBS洗涤3次，每次5min；

(2)固定：将-20℃、80％丙酮溶液加入细胞孔中，于2～8℃冰箱中固定30min，PBS洗涤3次，每次5min；

(3)一抗孵育：用PBS稀释抗CD163单克隆抗体(购自abcam)，稀释倍数为200倍，加入细胞孔中，湿盒37℃孵育60min，用PBS洗涤3次，每次5min；

(4)二抗孵育：用PBS稀释FITC标记羊抗鼠IgG二抗(购自siama)，稀释倍数为300倍，加入一抗孵育后的细胞孔中，湿盒37℃孵育60min，用PBS洗涤3次，每次5min；

(5)荧光观察及结果判定：将96孔板置于荧光倒置显微镜上观察，观察在暗室中进行。

荧光观察结果如图1(放大倍率为10倍)所示，可见由不同的Marc-145细胞株繁殖形成的多克隆贴壁细胞群中只有部分细胞的细胞膜有特异性荧光，这类细胞在细胞群中的占比约为50％，证明了在Marc-145多克隆贴壁细胞群中并非所有的Marc-145细胞表面都存在CD163受体。

1.3、利用多克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV并测定收获的病毒液中病毒含量

向步骤1.1的长满单层Marc-145贴壁细胞的培养瓶中按照1％接毒量接种PRRSV种毒(金宇保灵生物药品有限公司兽用疫苗国家工程实验室保存)，加入含有2％新生牛血清的DMEM维持液(商购)，于37℃培养36～48h有80％以上的细胞出现细胞病变，收获病毒液(重复三次)，按Reed-Muench法计算TCID₅₀值作为病毒含量，结果见下表1。可见利用该多克隆细胞群体外培养增殖PRRSV获得的病毒液中病毒含量基本保持在10^7.33TCID₅₀/ml左右。

实施例2：能够用于培养PRRSV以获得高病毒含量的病毒液的Marc-145单克隆贴壁细胞株的筛选

该实施例利用间接免疫荧光方法检测Marc-145贴壁细胞群(由单一Marc-145贴壁细胞株繁殖形成的单克隆贴壁细胞群)中细胞表面的CD163受体，并利用该单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV，以测定所获得的病毒液中的病毒含量，具体包括以下操作。

2.1、Marc-145单克隆贴壁细胞群的获得：将实施例1中步骤1.1长满单层且状态良好无外源病毒污染的Marc-145贴壁细胞用胰酶消化成单个散在细胞，用含10％新生牛血清的DMEM培养基稀释细胞，按照1～2个细胞/孔接种于96孔细胞培养板，置于37℃5％CO₂的条件下培养，标记只含1个细胞的孔，将这些细胞株分别命名为：D7、E7、G10、F9、F2、H5、C8、D9，待各孔中细胞数量增加后进行扩大培养(约7～14天，10％新生牛血清的DMEM培养基)，得到由单一Marc-145单克隆贴壁细胞株繁殖形成的Marc-145单克隆贴壁细胞群，对应于单克隆贴壁细胞株分别命名为：D7P、E7P、G10P、F9P、F2P、H5P、C8P、D9P。

2.2、按照实施例1中步骤1.2的间接免疫荧光检测方法分别检测各个Marc-145单克隆贴壁细胞群中细胞表面的CD163受体。

结果如图2-图5(放大倍率均为10倍)所示，仅示例性示出了E7P、F9P、C8P和D9P单克隆贴壁细胞群的荧光照片，其中图2为E7P单克隆贴壁细胞群的荧光照片，图3为F9P单克隆贴壁细胞群的荧光照片，图4为C8P单克隆贴壁细胞群的荧光照片，图5为D9P单克隆贴壁细胞群的荧光照片。明显可见，不同的单克隆贴壁细胞群中也都只有部分细胞的细胞膜有特异性荧光，且这类细胞膜具有特异性荧光的细胞在不同的单克隆贴壁细胞群中所占百分比也不同，即在不同的单克隆贴壁细胞群中，细胞表面存在CD163受体的细胞所占的百分比是有差异的，其中这类细胞在各个单克隆贴壁细胞群中所占的百分比示于下表1中。明显可见，这类细胞膜具有特异性荧光的细胞(即细胞表面存在CD163受体的细胞)在E7P单克隆贴壁细胞群中的占比最高，达到约90％，而在F9P单克隆贴壁细胞群中的占比最低，仅为约20％。

2.3、按照实施例1中步骤1.3的方法利用步骤2.1获得的各Marc-145单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV，并测定所获得的病毒液中病毒含量，结果见下表1。可见利用其中细胞表面存在CD163受体的细胞所占百分比不同的Marc-145单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV获得的病毒液中病毒含量也不同，并且随着细胞表面存在CD163受体的细胞占单克隆贴壁细胞群百分比的升高，利用该单克隆贴壁细胞群所获得的病毒液中病毒含量也升高，两者之间呈现明显正相关关系。

根据表1所列数据，明显可见，当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆贴壁细胞群中的占比达到约50％时，利用该单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV的多次重复试验所获得的病毒液中病毒含量均不低于10^7.0TCID₅₀/ml，平均值约为10^7.22-10^7.39TCID₅₀/ml；当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆贴壁细胞群中的占比达到约70％时，利用该单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV的多次重复试验所获得的病毒液中病毒含量均不低于10^7.5TCID₅₀/ml，平均值约为10^7.67TCID₅₀/ml；当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆贴壁细胞群中的占比达到约80％时，利用该单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV的多次重复试验所获得的病毒液中病毒含量均不低于10^8.0TCID₅₀/ml，平均值约为10^8.11TCID₅₀/ml；当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆贴壁细胞群中的占比达到约90％时，利用该单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV的多次重复试验所获得的病毒液中病毒含量均不低于10^8.33TCID₅₀/ml，平均值约为10^8.44TCID₅₀/ml；而当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆贴壁细胞群中的占比小于约50％时，利用该单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV的多次重复试验所获得的病毒液中病毒含量均低于10^7.0TCID₅₀/ml。即当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆贴壁细胞群中的占比达到50％时，利用该单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV所获得的病毒液中病毒含量可以达到10^7.0TCID₅₀/ml；当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆贴壁细胞群中的占比达到80％时，利用该单克隆贴壁细胞群体外培养增殖PRRSV所获得的病毒液中病毒含量可以达到10^8.0TCID₅₀/ml。因此可以直接利用细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆贴壁细胞群中的占比筛选出能够用来培养增殖PRRSV以获得高病毒含量(不低于10^7.0TCID₅₀/ml，甚至不低于10^8.0TCID₅₀/ml)病毒液的Marc-145单克隆贴壁细胞株，因此在表1所列的多种Marc-145单克隆细胞株中，E7单克隆贴壁细胞株是能够用于培养增殖PRRSV以获得最高病毒含量(平均达到10^8.44TCID₅₀/ml左右)病毒液的Marc-145贴壁细胞株，此外，D7、F2、C8和D9单克隆贴壁细胞株也是均能够用于培养增殖PRRSV以获得病毒含量为不低于10^7.0TCID₅₀/ml的病毒液的Marc-145贴壁细胞株。

表1：各单克隆细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比以及利用该单克隆细胞群培养增殖PRRSV获得的病毒液中病毒含量

实施例3：间接免疫荧光方法检测Marc-145悬浮细胞CD163受体

该实施例利用间接免疫荧光方法检测Marc-145多克隆悬浮细胞群(由不同的Marc-145悬浮细胞株繁殖形成的多克隆悬浮细胞群)中细胞表面的CD163受体，并利用该多克隆悬浮细胞群体外培养增殖PRRSV，以测定所获得的病毒液中的病毒含量，具体包括以下操作。

3.1、Marc-145悬浮细胞群的培养：将Marc-145悬浮细胞(金宇保灵生物药品有限公司兽用疫苗国家工程实验室保存)在细胞培养瓶中培养，生长液为CD293培养基(商购)，在37℃5％CO₂的恒温振荡培养箱中培养，培养2～3天，待细胞密度达到2×10⁶个/ml以上时，用CD293培养基将Marc-145悬浮细胞稀释至0.5-0.8×10⁶个/ml进行传代，待细胞生长至对数生长期时取细胞悬液滴加至载玻片上，置于超净台中进行风干。

3.2、间接免疫荧光方法检测Marc-145悬浮细胞群中细胞表面CD163受体

(1)固定：将-20℃、80％丙酮溶液滴加至载玻片上的细胞悬液中，于2～8℃冰箱中固定30min，PBS洗涤3次，每次5min；

(2)一抗孵育：用PBS稀释抗CD163单克隆抗体(购自abcam)，稀释倍数为200倍，滴加至载玻片上，湿盒37℃孵育60min，用PBS洗涤3次，每次5min；

(3)二抗孵育：用PBS稀释FITC标记羊抗鼠IgG二抗(购自sigma)，稀释倍数为300倍，滴加至一抗孵育后的载玻片上，湿盒37℃孵育60min，用PBS洗涤3次，每次5min；

(4)荧光观察及结果判定：将载玻片置于荧光倒置显微镜上观察，观察在暗室中进行。

3.3、向步骤3.1的培养瓶中的细胞密度达到2×10⁶个/ml的Marc-145悬浮细胞液中按照1％接毒量接种PRRSV种毒，加入含有2％新生牛血清的DMEM维持液，于37℃培养36～48h有80％以上的细胞出现细胞病变，收获病毒液(重复三次)，按Reed-Muench法计算TCID₅₀值作为病毒含量。

以上荧光观察结果和病毒含量检测结果表明，与上述实施例1的结果一致，也可见由不同的Marc-145悬浮细胞株繁殖形成的多克隆悬浮细胞群中只有部分细胞的细胞膜有特异性荧光，证明了在Marc-145多克隆悬浮细胞群中并非所有的Marc-145细胞表面都存在CD163受体。并且根据间接免疫荧光方法检测到的细胞表面存在CD163受体的细胞在Marc-145多克隆悬浮细胞群中的占比与利用该Marc-145多克隆悬浮细胞群体外培养增殖PRRSV获得的病毒液中病毒含量之间的关系符合上表1所示的规律。

实施例4：能够用于培养PRRSV以获得高病毒含量的病毒液的Marc-145单克隆悬浮细胞株的筛选

该实施例利用间接免疫荧光方法检测Marc-145悬浮细胞群(由单一Marc-145悬浮细胞株繁殖形成的单克隆悬浮细胞群)中细胞表面的CD163受体，并利用该单克隆悬浮细胞群体外培养增殖PRRSV，以测定所获得的病毒液中的病毒含量，具体包括以下操作。

4.1、Marc-145单克隆悬浮细胞群的获得：将Marc-145悬浮细胞在三角瓶中培养，生长液为CD293培养基，置于37℃5％CO₂的恒温振荡培养箱中培养，培养2～3天，待细胞密度达到2×10⁶个/ml以上时，用CD293培养基将Marc-145悬浮细胞稀释至0.5-0.8×10⁶个/ml进行传代，将处于对数生长期的Marc-145悬浮细胞用CD293培养基进行稀释成单个散在悬浮细胞，取多个单个散在悬浮细胞在半固体琼脂糖平板中培养，待单个悬浮细胞增殖成细胞团后进行扩大培养(约7～14天，CD293培养基)，得到对应的一系列由Marc-145单克隆细胞株繁殖形成的Marc-145单克隆悬浮细胞群。

4.2、待步骤4.1的各悬浮细胞群中的细胞生长至对数生长期时取细胞悬液滴加至载玻片上，置于超净台中进行风干，按照实施例3中步骤3.2的间接免疫荧光方法检测各Marc-145悬浮细胞群中细胞表面CD163受体。

4.3、按照实施例3中步骤3.3的方法利用步骤4.1获得的各Marc-145单克隆悬浮细胞群体外培养增殖PRRSV，并测定所获得的病毒液中病毒含量。

结果与实施例2获得的结果一致，利用其中细胞表面存在CD163受体的细胞所占百分比不同的Marc-145单克隆悬浮细胞群体外培养增殖PRRSV获得的病毒液中病毒含量也不同，并且随着细胞表面存在CD163受体的细胞占单克隆悬浮细胞群百分比的升高，利用该单克隆悬浮细胞群所获得的病毒液中病毒含量也升高，两者之间呈现如实施例2所述的明显正相关关系。即当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆悬浮细胞群中的占比达到50％时，利用该单克隆悬浮细胞群体外培养增殖PRRSV所获得的病毒液中病毒含量可以达到10^7.0TCID₅₀/ml；当细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆悬浮细胞群中的占比达到80％时，利用该单克隆悬浮细胞群体外培养增殖PRRSV所获得的病毒液中病毒含量可以达到10^8.0TCID₅₀/ml。因此也可以直接利用细胞表面存在CD163受体的细胞在单克隆悬浮细胞群中的占比筛选出能够用来培养增殖PRRSV以获得高病毒含量(不低于10^7.0TCID₅₀/ml，甚至不低于10^8.0TCID₅₀/ml)病毒液的Marc-145单克隆悬浮细胞株。

综上所述，可以通过利用间接免疫荧光方法检测Marc-145细胞群(Marc-145单克隆细胞群(贴壁或悬浮))中细胞表面存在CD163受体的细胞占细胞群的百分比来筛选能够用于体外培养增殖PRRSV以获得高病毒含量(例如不低于10^7.0TCID₅₀/ml，甚至不低于10^8.0TCID₅₀/ml)病毒液的Marc-145细胞株(包括Marc-145贴壁细胞株和Marc-145悬浮细胞株)。基于此，也可以利用间接免疫荧光方法检测Marc-145细胞群(包括Marc-145多克隆细胞群(贴壁或悬浮)和Marc-145单克隆细胞群(贴壁或悬浮))中细胞表面存在CD163受体的细胞占细胞群的百分比来预测利用该细胞群体外培养增殖PRRSV所获得的病毒液中病毒的含量，进而可以用于指导PRRSV疫苗的生产，预测判断标准为：若Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到50％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于10^7.0TCID₅₀/ml；若Marc-145细胞群中细胞表面存在CD163受体的细胞占比达到80％，则利用该Marc-145细胞群培养PRRSV获得的病毒液中病毒含量平均值不低于10^8.0TCID₅₀/ml。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。