一种dlbcl相关的生物标记组合物及其应用、dlbcl预后的效果预测模型
技术领域
本申请涉及医学治疗效果预测的
技术领域
，更具体地说，它涉及一种DLBCL相关的生物标记组合物及其应用、DLBCL预后的效果预测模型。背景技术
弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B—cell lymphoma，DLBCL)是一种成熟B细胞恶性肿瘤，在成人非霍奇金淋巴瘤(non—Hodgkin lymphoma，NHL)中最常见。在我国，DLBCL发病率占NHL的40.1％，并因其高发病率和高致死率受到越来越多的关注。
DLBCL的发病机制尚不明确，有多项研究表明可能与炎症引起的免疫功能失调相关，这种炎症引起的免疫功能失调作用通常由细胞因子来介导。作为DLBCL的一线经典治疗方案，目前R-CHOP方案可以使大部分患者的病情得到有效缓解，但仍有相当一部分患者对R-CHOP不敏感，或者有一部分患者会在治疗后出现早期复发的情况。介于这种预后的高异质性，使得预后分层(即先把患者分类，再在每类中分别评估预后)成为优化治疗时非常重要的一个考虑方向。
IPI评分标准作为当前DLBCL患者预后评估的金标准，其未能反映免疫逃逸在疾病发生发展中的作用，因此难以避免在发生免疫逃逸时出现预后效果预测不准确的情况。此外，自从联合使用利妥昔单抗(rituximab，R)进行标准治疗后，IPI评分标准的准确性有所下降。国外的研究表明，一些细胞因子表达水平与DLBCL发病、病情轻重及预后有密切关系。目前国内的相关研究很少，鉴于国内外环境、患者发病因素差异及DLBCL的高度异质性，寻找新的生物标记物，并探索一种能够更加准确、高效地预测DLBCL患者的预后效果，进而完善IPI评分体系是非常必要的。
发明内容
为了提高DLBCL预后的效果预测的准确性，本申请提供一种DLBCL相关的生物标记组合物及其应用、DLBCL预后的效果预测模型。
第一方面，本申请提供一种DLBCL相关的生物标记组合物，采用如下的技术方案：一种DLBCL相关的生物标记组合物，所述生物标记组合物包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-17中的至少三种。
通过采用上述技术方案，本申请通过大量的实验发现了和DLBCL相关的生物标记物，患有DLBCL的患者的上述细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-17)的含量和健康人群的相比显著不同(高于或者显著高于健康人群)，因此能够通过上述的生物标记组合物的含量定性判断DLBCL的发生。
优选的，生物标记组合物可以用于DLBCL预后的效果预测。
治疗有效组的患者的上述生物标记组合物中的细胞因子的含量和治疗无效组的相比具有显著升高的趋势。因此通过采用上述的生物标记组合物中的细胞因子的含量来预测DLBCL预后的效果是可行和有效的，并为DLBCL的预后分析及临床治疗提供了新的思路。
优选的，所述生物标记组合物包括IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ中的至少三种。
本申请中相关的数据结果显示，DLBCL患者的IL-6和IL-10的含量与健康人群相比显著升高，IFN-γ的含量也明显升高，TNF-α的含量在DLBCL患者和健康人群中虽无明显统计学差异，但仍存在明显的升高趋势。因此，选择IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ中的任意三种能够更加准确高效地分析和预测DLBCL，并能够提供DLBCL预后效果的高准确率的预测。
优选的，所述生物标记组合物为IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ。
以IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ四种细胞因子共同作为预测DLBCL预后治疗效果的生物标记物，其能够高效、准确地预测DLBCL预后治疗效果。
第二方面，本申请提供一种生物标记组合物的应用，采用如下的技术方案：
上述的生物标记组合物的应用，所述生物标记组合物用于DLBCL预后的效果预测。
目前R-CHOP方案作为DLBCL的一线经典治疗方案，能够使大部分患者的病情得到缓解，但仍有相当一部分患者对R-CHOP不敏感或者早期复发的患者存在。介于这种预后的高异质性，能够采用适当的预后分层对优化治疗非常重要。其中，IPI评分作为当前DLBCL患者预后评估的金标准，其也未能反映免疫逃逸在疾病发生发展中的作用，且自从联合使用利妥昔单抗(rituximab，R)进行标准治疗后，IPI的准确性有所下降。而通过采用上述技术方案，其在进行DLBCL预后的效果预测时，选取多种适当的细胞因子(即生物标记组合物)，在DLBCL预后，通过联合该多种适当的细胞因子的含量数据进行DLBCL预后的效果预测。其能够有效提高DLBCL患者预后的效果预测准确性，并弥补了因联合使用利妥昔单抗进行标准治疗后IPI评分准确性下降的不足。
第三方面，本申请提供一种DLBCL预后的效果预测模型，采用如下的技术方案：一种DLBCL预后的效果预测模型，所述预测模型为SVM预测模型，所述SVM预测模型的类型为C-classification，SVM核为Linear或Polynomial或Radial Basis Function(RBF)，C为0.500～0.999；初始数据为权利要求1所述生物标记组合物中各细胞因子的含量。
本申请通过流式细胞术检测DLBCL患者的各细胞因子的表达情况，探讨DLBCL患者细胞因子表达谱检测分析体系，以期为DLBCL的预后分析及临床治疗提供新的思路。其将SVM用于DLBCL预后的效果预测和评价，其筛选得到多种适当的细胞因子，并将细胞因子的含量值作为初始数据输入SVM算法中，并建立和优化得到SVM预测模型，进而最终得到预测准确率高的DLBCL预后的效果预测模型。
优选的，所述生物标记组合物为IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ。
通过采用上述技术方案，以上述IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ含量作为初始数据，并结合SVM预测模型，能够得到预测准确率更高的DLBCL预后的效果预测模型。
优选的，所述预测模型采用包括以下步骤的方法构建得到：
S1、测定经治疗后DLBCL患者血液中的所述生物标记组合物中各细胞因子的含量，并进行统计学分析；
S2、将S1中得到的各细胞因子含量的数据结果和应用于所述支持向量机中，构建得到DLBCL预后效果的SVM预测模型。
优选的，所述SVM核为RBF核。
优选的，所述SVM预测模型的最优C为0.895。
通过采用上述技术方案，以该最优的SVM预测模型，并结合IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ的DLBCL预后含量数据，能够更加准确地预测DLBCL预后(即短期治疗)的效果，其预测准确率高达75.00％～82％。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请首先提出了一种DLBCL相关的生物标记组合物，其包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-17中的至少三种；其以细胞因子的含量反映DLBCL的相关信息，并以上述细胞因子的含量能够进行DLBCL预后的效果预测(或评价)。
2、在上述生物标记组合物的前提下进一步优化得到DLBCL相关的生物标记组合物为IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ，上述四种细胞因子和DLBCL的确诊以及DLBCL预后的效果评分更加相关，能够更加准确高效地反映DLBCL预后的效果。
3、本申请通过将IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ含量数据和SVM算法相结合，进而得到一种DLBCL预后的效果预测模型，该预测模型的准确率高达75.00％～82％。
附图说明
图1是本申请实施例中IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ在DLBCL、CLL组及健康对照组间的差异性表达结果：其中，1-A图展示的是IL-6在DLBCL、CLL组及健康对照组间的差异性表达结果，1-B图展示的是IL-10在DLBCL、CLL组及健康对照组间的差异性表达结果，1-C图展示的是TNF-α在DLBCL、CLL组及健康对照组间的差异性表达结果，1-D图展示的是IFN-γ在DLBCL、CLL组及健康对照组间的差异性表达结果；
图2是本申请实施例中不同IPI分值的DLBCL患者的IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ细胞因子的表达水平：其中，2-A图展示的是不同IPI分值的DLBCL患者的IL-6细胞因子的表达水平，2-B图展示的是不同IPI分值的DLBCL患者的IL-10细胞因子的表达水平，2-C图展示的是不同IPI分值的DLBCL患者的TNF-α细胞因子的表达水平，2-D图展示的是不同IPI分值的DLBCL患者的IFN-γ细胞因子的表达水平；2-E图展示的是不同IPI分值的人数分布情况：IPI分值为2的有10人，IPI分值为3的有16人，IPI分值为4的有17人，IPI分值为5的有6人；
图3是本申请实施例中短期治疗有效组和无效组的IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ细胞细胞因子表达的差异：其中，3-A图展示的是治疗有效组和无效组的IL-6细胞因子的表达水平，3-B图展示的是治疗有效组和无效组的IL-10细胞因子的表达水平，3-C图展示的是治疗有效组和无效组的TNF-α细胞因子的表达水平，3-D图展示的是治疗有效组和无效组的IFN-γ细胞因子的表达水平，3-E图展示的是治疗有效组和无效组的人数分布情况：治疗有效组的有21人，治疗无效组的有28人。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
DLBCL的生物标记组合物的实施例
DLBCL的生物标记组合物的筛选过程具体为：
(1)选取2017年1月至2020年1月在浙江省人民医院血液科、肿瘤科经病理活检明确为B-NHL(B细胞-非霍奇金淋巴瘤)的患者77例，其中慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(Chronic lymphocytic leukemia/Small lymphoticlymphoma，CLL/SLL)11例(男6例，女5例，年龄55～85岁，中位年龄72岁)，DLBCL患者52例(男33例，女19例，年龄36～91岁，中位年龄65岁)。所有入选的B-NHL患者无自身免疫性疾病、严重感染、第二肿瘤及其他血液疾病。以56例体检健康者为对照组(其中男34例，女22例，年龄24～78岁，中位年龄55岁)。3组患者性别、年龄差异无统计学意义(P＝0.461、0.114)，具有可比性。末次随访时间2020年7月，最短随访时间为6个月。
52例DLBCL患者中，有3例患者未经治疗自动出院，49例按R-CHOP方案化疗，21天为一个疗程，所有患者治疗3个疗程后按照《血液病诊断及疗效标准》的标准预测和评价近期疗效。其中，完全缓解和部分缓解组为治疗有效组，疾病进展和未缓解的为治疗无效组。
(2)细胞因子检测测定未经治疗前各组患者和健康对照组血清细胞因子浓度，以及持续缓解组缓解期细胞因子浓度。其各细胞因子的浓度测定采用流式细胞仪，按操作说明书使用TH1/Th2/Th17 CBA细胞因子试剂盒测定7种细胞因子浓度(包括IL2、IL4、IL6、IL10、IL17、TNF-α及IFN-γ)，所有受检者均采集空腹肘静脉血，静置，离心分离血清，4℃保存备用血清，并在24h内完成相关细胞因子的测定。具体结果见表1。
表1 7种细胞因子在DLBCL组、CLL组和正常对照组的表达情况(ng/L，中位数(25％，75％))
注：a标记的数据为DLBCL组和健康对照组比较的Z值、P值，b标记的数据为CLL组和健康对照组比较的Z值、P值；其中，表格中展示的是某一细胞因子的表达量(ng/L)、中位数(25％)时该细胞因子的表达量(ng/L)以及中位数(75％)时该细胞因子的表达量(ng/L)。
从表1的数据结果中看出，其中，DLBCL组患者的IL-6、IL-10与健康对照组相比显著升高，IFN-γ也明显升高。
随后统计IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ在DLBCL、CLL组及健康对照组间的差异性表达，具体结果见图1。从图1中看出，DLBCL组患者的IL-6、IL-10与健康对照组相比显著升高，IFN-γ也明显升高；而TNF-α在两组间虽无明显统计学差异，但仍存在明显的升高趋势。
因此，结合表1和图1的数据结果，确定DLBCL的生物标记组合物包括IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ。
DLBCL患者预后的预测模型实施例(一)DLBCL患者细胞因子表达水平与IPI评分的相关性
49例DLBCL患者IPI评分分布见图2：在DLBCL患者中，不同IPI分值的各组患者血清IL-6，IL-10存在显著性差异；TNF-α在各组间虽没有统计学差异，但在IPI为2分组和3分以上组相比仍然有一个明显的升高趋势，见图2。自表2中看出：IPI为2分的患者和IPI为3-5分的各组患者相比血清IL-6和IL-10均明显降低，并且IPI分值和血清IL-6、IL-10水平呈正相关。其中，IPI评分为0或1的，为低危型患者，一般认为治疗5年后的患者的生存率为73％；IPI评分为2的，为中低危型患者，一般认为治疗5年后的患者的生存率为51％；IPI评分为3的，为中-高危型患者，一般认为治疗5年后的患者的生存率为43％；IPI评分为4或5的，为高危型患者，一般认为治疗5年后的患者的生存率为26％。
表2不同IPI分值的DLBCL患者间细胞因子的差异性
注：表格中“2vs3”的含义为“IPI评分值为2的和IPI评分值为3的相比”，“2vs4”、“2vs5”的含义和“2vs3”的含义类似，即分别为“IPI评分值为2的和IPI评分值为4的相比”和“IPI评分值为2的和IPI评分值为5的相比”。
因此，从图2和表2的数据中均可以看出，IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ这四种细胞因子和现有的预后评价体系的IPI评分值均有相关性，通过IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ这四种细胞因子预测DLBCL预后效果是合理的。
(二)DLBCL预后的效果预测模型
在实施例1中，已经筛选得到52例DLBCL患者中，有3例患者未经治疗自动出院；其余的49例DLBCL患者按R-CHOP方案化疗，21天为一个疗程，所有患者治疗3个疗程后按照《血液病诊断及疗效标准》的标准评价和预测近期疗效，进行IPI预后评价。其中，病情完全缓解和部分缓解组为治疗有效组(共28例)，疾病进展中和病情未缓解的为治疗无效组(共21例)。
测定治疗有效组和治疗无效组的患者的血清中各细胞因子浓度，其各细胞因子的浓度测定采用流式细胞仪，按操作说明书使用TH1/Th2/Th17 CBA细胞因子试剂盒测定7种细胞因子浓度(包括IL2、IL4、IL6、IL10、IL17、TNF-α及IFN-γ)，所有受检者均采集空腹肘静脉血，静置，离心分离血清，4℃保存备用血清，并在24h内完成相关细胞因子的测定。具体结果见表3。
表3短期治疗有效和治疗无效的DLBCL患者血清细胞因子(ng/L，中位数(25％，75％))
组别
治疗无效组
治疗有效组
Z值
P值
IL-2
1.22(0.67，2.40)
0.98(0.76，2.02)
1.384
0.166
IL4
1.39(0.90，2.44)
1.29(0.76，2.02)
0.778
0.437
IL-6
87.43(33.53，232.49)
10.47(5.09，25.32)
4.303
0
IL-10
59.31(18.79，230.51)
8.73(2.94，25.04)
3.374
0.001
TNF-α
2.84(0.88，4.68)
1.62(0.72，2.29)
2.293
0.022
IFN-γ
3.6(2.36，4.68)
2.45(1.44，3.04)
1.283
0.2
IL-17
2.09(0.31，3.34)
1.35(0.75，3.34)
0.667
0.505
注：表格中展示的是某一细胞因子的表达量(ng/L)、中位数(25％)时该细胞因子的表达量(ng/L)以及中位数(75％)时该细胞因子的表达量(ng/L)。
表3的结果显示与治疗有效的患者相比，治疗无效的患者表达更高的血清IL-6和IL-10(P<0.01)，TNF-α也有明显升高，见表3。
随后统计IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ在治疗有效组和治疗无效组间的差异性表达，具体结果见图3。从图3中看出，IFN-γ在两组间虽没有统计学差异，但治疗无效组和治疗有效组相比仍有明显的升高趋势。
随后将上述细胞因子数据分别拆分为两组，80％的分为一组，为训练集，用于训练；20％的为一组，为测试集，用于测试。优选的SVM模型如下：类型为C-classification，SVM核为Radial Basis Function(RBF)核，C为0.895。
DLBCL患者预后的预测模型的应用例
采用如下最优的SVM模型：类型为C-classification，SVM核为RBF，最优C为0.895。
随后，首先分别检测10组患者的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-17的含量，随后将检测的数据结果应用于上述优化的SVM模型中，以此最优SVM模型预测测试组10例，得到预测分组的情况，并和实际分组情况相比较后得出预测测试组的准确率为80.00％。具体结果如表4所示。
表4
注：分组情况中的“1”指的是经检测，肿瘤残留病灶显示阳性，因此被认定预后治疗效果差的一组，分组中的“0”指的是经检测，肿瘤残留病灶显示阴性，因此被认定预后治疗效果好的一组。
而采用现有技术中的IPI评分对其预后效果进行预测，其最终的测试准确率在62.37～71.43％的范围内；在本实施例中，其测试准确率仅为70％。具体的结果见表5。
表5
注：分组情况中的“1”指的是经检测，肿瘤残留病灶显示阳性，因此被认定预后治疗效果差的一组，分组中的“0”指的是经检测，肿瘤残留病灶显示阴性，因此被认定预后治疗效果好的一组。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
