发明内容

为了克服现有技术中的上述缺陷，缩短毛干蛋白提取时间，提高实验效率、准确性和灵敏度，节省人力和时间，建立毛干蛋白快速稳定的提取策略，本发明人经过长期的研究探索，提出了一种适用于质谱鉴定的毛干蛋白质提取方法，本发明的提取方法能够简便高效提取毛干样本中的蛋白质，具有稳定快速、杂质含量少的特点。通过本发明的提取方法对样本进行高效的蛋白质提取，然后采用质谱仪进行高灵敏度蛋白质组学检测，获得质谱数据，可以进一步用于SNP位点检测和个体鉴定等领域。

本发明的第一方面公开了一种适用于质谱鉴定的毛干蛋白质提取方法，包括步骤：

S101，毛干样本预处理。

对毛干样本进行漂洗、研磨。其中，所述漂洗可以采用自来水、去离子水、蒸馏水等进行。

优选地，采用去离子水进行漂洗以减少油脂，降低检测干扰。

优选地，使用研磨仪在低温条件对漂洗干净的毛干样本进行研磨，以得到粉末状的毛干样品。其中，所述低温条件为液氮或干冰环境下-70℃至-50℃。低温防止试管过热碎裂。

以往通常采用手工研磨，研磨费时费力，且研磨效果不彻底，样品残留和损失很严重。本发明优选地使用研磨仪在低温条件下进行研磨，不仅省时省力提高效率，而且研磨效果很好，可以将毛干样品研磨至粉末状，大大增加了样品的表面积，实验结果也表明低温研磨最后得到的蛋白量较之前的实验方法有了大幅度提升。

S102，超声处理。

在预处理后的毛干样本中加入增溶溶液，并进行超声处理，以得到样本蛋白质混合物。这一步骤的目的是最大程度地释放出蛋白质。

其中，增溶溶液含有缓冲液和表面活性剂。所述表面活性剂的作用为促进头发样品中蛋白质的释放。其中，所述缓冲液选自三乙胺-碳酸缓冲液(TEAB)。其中，所述缓冲液在增溶溶液中的浓度为50-150mM。其中，所述表面活性剂为十二烷基磺酸钠(SDS)。其中，所述表面活性剂在增溶溶液中的浓度为1-5％。其中，样本和增溶溶液的用量比体积比为1:(20-50)，优选地为1:30。其中，所述增溶溶液的pH值为8-8.5。

优选地，本发明所采用的超声处理装置包括换能器以及超声发生器，所述换能器第一端连接所述超声发生器，所述换能器远离所述第一端的相对端包括一个或多个超声发生槽，将所述毛干样本与增溶溶液的混合物直接置入所述超声发生槽，以进行超声处理。

本发明所采用的超声处理装置区别于现有的水浴超声仪以及探针式超声破碎仪。

现有的水浴超声仪的超声强度较低，而毛干样品致密，需要高强度才能有效处理，水浴超声仪无法满足毛干样品的处理强度。探针式超声破碎仪需要将探针插入样品溶液中进行超声处理，然而毛干样品极易缠绕在超声探针上，样品易溅出造成的蛋白损失，处理效果十分不理想。

本发明超声处理装置直接将需进行超声处理的样品放置于换能器的超声发生槽中，避免了超声处理过程中样品溅出造成的大量蛋白损失，超声强度高，增加蛋白质提取量，提升效果，且效率较高。当采用多个超声发生槽时，同时能够进行多个样品的超声处理，进一步提高了效率。

其中超声处理的时间为20-30分钟。

同时，由于本发明的高强度超声波处理会产生热量，通过对超声的工作时间，以及间隔暂停时间控制即可控制反应温度，从而达到水浴的效果，无需再另外水浴或加热处理。

S103，萃取蛋白质。

这一步骤的目的是从S102步骤得到的样品蛋白质混合物中萃取得到蛋白质，去除步骤S102中的SDS，洗去蛋白质中的杂质。

通过向步骤S102的混合物中加入三氯乙酸(TCA)、磷钨酸(PTA)溶液(两者合称为PP溶液)，以沉淀蛋白质。其中TCA的浓度为10-20％，PTA的浓度为0.1-1％。其中，在加入TCA、PTA溶液后室温振荡30min，静置后离心弃上清，以获取蛋白质沉淀。其中，本步骤中TCA、PTA溶液的与样品的体积比为(1.5-5)：1。

优选地，本发明为了更好地洗去蛋白质中的杂质，在蛋白质沉淀中加入SDS以及pp液溶液，用水浴超声的方式得到沉淀，静置后离心，重复多次，洗去蛋白沉淀中的杂质。其中，SDS溶液的浓度为1-5％。通过本步骤可以使得提取的蛋白杂质少，避免对质谱检测的影响，提高结果的准确性

再次加入相同浓度的TCA、PTA溶液，超碎沉淀，静置后离心，重复多次，以洗去蛋白沉淀中的杂质，进一步提纯蛋白质，提高检测准确性。其中，本步骤中TCA、PTA溶液的用量为300-1000ul。

将去除杂质后的蛋白质沉淀中加入100ul 0.1％SDS以及100mM TEAB溶液，以复溶沉淀，超声震碎沉淀，并调PH至8-8.5。

S104，制备肽混合物。

向步骤S103得到的混合物中加入胰酶对蛋白质进行酶切。获得毛干样本的肽混合物。

其中，所述酶切的温度为37℃。其中，所述酶切的时间为4-8h。其中，所述酶切后加三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原二硫键，再加入甲基硫代磺酸甲酯(MMTS)去除多余的TCEP，根据蛋白量确定是否需要补加胰酶。反应后得到肽混合物，加酸调PH至2-3终止酶切。

S105，除盐处理。

为了提高质谱识别的几率，提高对蛋白质谱分析精度，本发明对得到的样品的肽混合物进行除盐处理。根据不同的蛋白量选择合适规格的除盐板以对肽混合物进行除盐。

本发明的第二方面公开了一种超声处理装置，用于破碎生物样品，所述超声处理装置包括换能器以及超声发生器，所述换能器第一端连接所述超声发生器，所述换能器远离所述第一端的相对端包括一个或多个超声发生槽，所述超声发生槽用于容纳所述生物样品以进行超声处理。

换能器为发射换能器。优选地，本发明的换能器采用压电晶体振子，所述振子与所述超声发生器连接，超声发生器将产生高频率的电信号，然后产生的电信号加载到超声波换能器的振子，由振子自身的简谐振动并带动整个换能器共振，从而将电能转化为机械能，从而进行超声波振动。振子采用夹心式结构，由预应力螺栓把前后驱动块、压电晶片和电极片夹紧组成。当在压电晶片两极施加电压时，由于压电陶瓷材料的逆压电效应，压电晶片会在厚度方向(即换能器的轴向)产生形变，该形变在交变电流的作用下反复伸张压缩从而将电能转化为机械能。

优选地，本发明所述换能器还包括调幅器，振子在交变电流的作用下以谐振频率发生周期性的伸张压缩形变，同时也带动调幅器共振，这样振子和调幅器就各自变成了一个简谐振动单元，振子受电信号激励，再激励调幅器，两者共振。

所述振子以及换能器设置在所述换能器第一端。

优选地，超声发生器包括控制单元，所述控制单元用于控制超声发生强度，发生时间以及工作间隔暂停时间。

本发明的超声处理装置可在现有的超声破碎装置或超声焊接装置的基础上进行改装。例如，现有探针式超声破碎装置的换能器为探针状，在使用时将探针插入样品溶液以进行超声处理，本发明将探针状的换能器去除，替换为本发明所述换能器，并与现有的超声破碎装置的超声发生器以及控制器连接，从而能够高效、低成本地进行生物样品破碎。

本发明的超声处理装置，采用在换能器的相对端设置超声发生槽，从而将待处理样本混合物直接置于超声发生槽中进行超声处理，有效解决了现有的探针式超声破碎装置造成样品溅出、缠绕的问题，且超声强度高，功率可达3500w。本发明的超声处理装置处理毛发外，对于骨头、指甲、牙齿等较为坚硬的样品均有较佳的处理效果。

本发明还提供了所述的提取方法、超声处理装置在用于毛干蛋白提取、或进一步用于质谱分析、或进一步进行个体鉴定中的应用。

本发明的第三方面提供了一种超高灵敏度蛋白质谱检测方法，其特征在于使用上述的适用于质谱鉴定的毛干蛋白质的提取方法对样本进行处理以提取毛干蛋白质并用于质谱分析。

本发明的超高灵敏度蛋白质谱检测方法，使用适用于色谱-质谱联用系统的毛细管分析柱(毛细管色谱柱)。

所述分析柱包括柱管，毛细管整合发射尖端，填充在管腔中的填料，用于支撑填料的熔块。

本发明中，所述毛细管分析柱为填充毛细管柱(微填柱)，所述分析柱可以是石英、玻璃、金属、尼龙等管材。优选地，本发明采用聚酰亚胺包被的石英毛细管(聚酰亚胺包被的SiO2毛细管)，其具有弹性好、表面惰性、使用寿命长等优点(由于石英毛细管柱很脆，通常通过外涂一层聚酰亚胺保护材料以保证其良好的弹性)。

本发明中，所述毛细管分析柱的长度可以是任何合适作为LC-MS分析的长度，本领域技术人员根据实际需要可以确定合适的柱长。考虑到本发明所述分析柱的内径较小，为防止填料带来的传质阻力，因此，本发明所述分析柱的总长不能太长。优选地，所述分析柱的长度为5～20cm；进一步优选地，所述分析柱的长度为10～20cm；进一步优选地，所述分析柱的长度为10～17cm；更进一步优选地，所述分析柱的长度可以是10、11、12、13、14、15、15.5、16、16.5、17cm等中的一种。

本发明中，所述分析柱的外径可以是200～500μm；优选地，所述外径为300～400μm；进一步优选地，所述外径为300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400μm中的一种。

本发明中，为实现高效、超高灵敏度蛋白质谱检测，所述分析柱的内径≤30μm；进一步优选地；所述分析柱的内径≤25μm；进一步优选地；所述分析柱的内径为5～25μm；进一步优选地；所述分析柱的内径为10～25μm；进一步优选地，所述分析柱的内径为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25μm等中的一种。

本发明中，所述毛细管整合发射尖端直径≤2μm；优选地，所述毛细管整合发射尖端直径≤1.5μm；进一步优选地，所述毛细管整合发射尖端直径≤1.2μm；更进一步优选地，所述毛细管整合发射尖端直径≤1μm。

本发明中，所述毛细管末端构建有熔块，本领域技术人员通过毛细管的总长度，可以合理确定所述熔块的厚度(沿毛细管长度方向)；优选地，当毛细管分析柱的长度为5～20cm时，所述熔块的厚度为1～2.5mm；优选地，所述熔块的厚度为1.5～2.5mm；进一步优选地，所述熔块的厚度为1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1或2.2mm。

本发明中，所述本领域技术人员通过毛细管的总长度，可以合理确定熔块离毛细管整合发射尖端的距离；优选地，当毛细管分析柱的长度为5～20cm时，所述熔块近毛细管整合发射尖端的距离为1-4mm，优选为2～3mm(所述距离是指从熔块离毛细管整合发射尖端最近的一面开始计算的距离)。

本发明中，所述熔块是由通过毛细管的虹吸现象吸入的硅酸盐溶胶-凝胶体系在一定温度下自交联形成的高强度、三维孔塞状的聚合物或固体。其中，所述熔块具有高强度和高渗透性等特点，其作用是堵住固定相填料，防止填料的流失，同时具有良好的通透性以保持溶剂和待测物质通过，防止过高的阻力。其中，所述高强度是指所述熔块能够承受至少4000psi的压力，优选能承受2500psi及以上的压力。其中，所述孔塞状是指所述聚合物或固体具有孔状结构，所述孔状结构的孔径应小于填料的直径，例如可以是1μm、2μm、0.5μm。

其中，所述硅酸盐选自硅酸铝、硅酸铁、硅酸钙、硅酸镁、硅酸钾、硅酸钠、硅酸锰等中的一种或几种；优选地，所述硅酸盐为硅酸铝、硅酸钾、硅酸锰的混合物，其中硅酸铝、硅酸钾、硅酸锰的摩尔比为(9-10)：(15-16)：(1-1.5)，优选为9:15.5:1。

其中，所述硅酸盐在促溶胶-凝胶形成的溶剂的条件下形成所述硅酸盐溶胶-凝胶体系，所述促溶胶-凝胶形成的溶剂为水、冰醋酸、碱、乙醇、异丙醇等中的一种或几种；优选地，为体积比为3:1的水和异丙醇，或体积比为3:1的冰醋酸和异丙醇。

对熔块的材料、通透性、机械强度、厚度等参数的调控是制备高质量颗粒填充毛细管柱的关键环节。本发明熔块的制备方法简单，便于操作，重复性好；通过所述方法制备得到的熔块具有良好的机械性能、机械稳定性和通透性，可以保证良好的柱效。

本发明中，所述填料可以采用任意能够实现高灵敏度蛋白质谱检测的物质，包括但不限于硅胶、有机聚合物、多糖(葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶)等。由于本发明所述毛细管内径很小，如果填料粒径、表面特性、均一性等性能不能有效控制时，则很难填充到所述毛细管柱的腔体内；因此，具有合适粒径、表面特性、均一性等性能的填料是成功制备毛细管分析柱的关键。因此，适用于本发明所述毛细管分析柱的填料为微米级颗粒，表面光滑，其粒径≤3μm。优选地，所述填料的粒径可以是2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0μm，或小于1.0μm。

本发明中，优选地，本发明所述填料具体涉及一种改性硅基微球，即改性有机聚合物包裹的硅基微球，其表面光滑、粒径均一(2.0-4.0μm)，表面具有微孔所述改性有机聚合物覆盖在硅球表面，能够降低硅基微球之间的摩擦力，能够提高该填料的光滑程度，利于毛细管制备过程中填料的填充。

本发明中，所述改性硅基微球的制备方法包括：以N，N-二甲基十六胺、NH4F作为改性剂，在冰醋酸、水、乙醇的存在下，聚合物单体发生聚合反应形成交联的聚合物，覆盖在硅基微球表面，即所述改性硅基微球。

其中，所述改性剂的质量占总反应体系质量的6-9％；优选地，为7.8％。

其中，所述聚合物单体的质量占总反应体系质量的10-12％；优选地，为11％。

其中，根据分析需要选择不同的单体进行聚合物合成，从而得到能够提高分析效果的改性硅基微球。优选地，所述聚合物单体包括三氯乙烯、二乙烯基苯、苯乙烯、乙烯基吡咯烷酮、乙烯基吡啶中的任意一种或几种。优选地，所述聚合物单体为苯乙烯、乙烯基吡咯烷酮、乙烯基吡啶的混合物，所述苯乙烯、乙烯基吡咯烷酮、乙烯基吡啶的摩尔比为(4-8):(2-5):(10-15)，优选为5:3:12，采用该优选方法获得的改性硅基微球，其表面包裹的改性苯乙烯-乙烯基吡咯烷酮-乙烯基吡啶聚合物能够降低硅基微球之间的摩擦力，提高表面光滑度，粒径≤3μm，大小均一，表面微孔为

其中，所述聚合反应的温度为300-400℃；优选地，为380℃。

其中，所述聚合反应的时间为5-6h；优选地，为5.5h。

分离度是蛋白质分离程度的量化指标，通过上述方法制备得到的改性硅基微球为粒径≤3μm，大小均一，孔径为的改性有机聚合物包裹的硅基微球，其本身的表面特性、粒径、均一度、孔结构等使得其用作毛细管柱的填料，在进行色谱分析时可以得到良好的效果，能够满足有效分离蛋白，实现高灵敏度蛋白质谱分析的目的，进而决定了本发明的毛细管分析柱适用于蛋白尤其是复杂生物样本中低含量蛋白的分离检测。

在一实施方式中，所述填料的制备步骤包括：将聚合物单体溶解在冰醋酸、水、乙醇中，加入改性剂N，N-二甲基十六胺、NH4F，所述改性剂的质量为总反应体系质量的6-9％，所述聚合物单体的质量占总反应体系质量的10-12％，超声混合20min，进行聚合反应。

本发明的第四方面提供了一种基于毛干蛋白质组学测定SNP位点的方法，使用上述的适用于质谱鉴定的毛干蛋白质的提取方法对样本进行处理，并用质谱仪进行蛋白质组学检测，采集质谱数据，所述方法包括如下步骤：

S2、获取公共数据库中的SNP位点信息,对SNP位点进行筛选，得到导致编码氨基酸(Amino Acids，AA)改变的SNP位点列表。

进一步的，该步骤的具体操作包括以下步骤：

S201、获取公共数据库的SNP位点信息，下载对应的VCF文件和参考基因组。所述公共数据库可以包括表1中的一个或多个公共数据库。

表1

优选地，本发明选择使用1000Genome和dbSNP两个数据库的SNP位点信息。

1000Genome是千人基因组计划建立的数据库，该项目将来自世界各地研究所的多学科研究团队联合起来，包括中国，意大利，日本，肯尼亚，尼日利亚，秘鲁，英国和美国。每一个都将为庞大的序列数据集和精细的人类基因组图谱做出贡献，这些图谱通过公共数据库免费提供给科学界和公众，为人类遗传变异的研究提供了一个综合的资源。从中获取的SNP位点信息有很高的权威性，并且可以适用于多个人群。

dbSNP是NCBI中专门用于存储物种SNP位点信息的数据库，其中人的common_all.vcf.gz文件包含了至少一个主要人群中次要等位基因频率(Minor AlleleFrequency，MAF)的所有被研究过的突变位点。

因此，上述2个数据库具有数据权威性与准确性，且由于上述2个数据库中的数据可以供本发明在后续步骤中进行人群突变频率分析筛选，从而进一步提高了本法明检测查全率与查准率。

所述VCF文件的数据记录部分由以空格键分割的多列组成，前八列表示变异位点的相关信息，分别为：染色体名称、变异位点在染色体上的位置、变异位点在已有数据库中的ID号(当不存在时可以用“.”表示)、参考碱基、变异碱基、质量得分、是否通过过滤标准、相关信息(例如测序深度)；其后每一列表示某个样本在该位点的信息(例如突变频率)。

S202、对公共数据库的SNP位点信息进行筛选，得到导致编码氨基酸改变的SNP位点列表。

将S201步骤中获取的VCF文件中的SNP位点信息和参考基因组比对分析，得到外显子区域的突变且突变后会导致编码氨基酸有所改变的SNP位点列表。

更进一步的，挑选VCF文件中SNP位点的具体操作为：

S2021、使用注释软件，对VCF文件基于参考基因组进行注释，以得到对应VCF文件中所有外显子区域的突变，输出每个SNP对应的所属氨基酸原始序列和突变后的序列。

S2022、对原始氨基酸序列和突变后对应的氨基酸序列两两比较，挑选出氨基酸序列有改变的SNP位点列表。

通过S202步骤从海量的SNP信息中筛选出来了与氨基酸序列改变有关的SNP位点，从而为后续步骤构建蛋白质数据库，以及进一步在蛋白质层面进行数据分析提供了基础。

更进一步的，在注释SNP时，为了保障数据的可靠性以及权威性，应当使用具有可靠来源的当前最新参考基因组。本发明中针对1000Genome的VCF文件使用hg19版本的参考基因组，针对dbSNP的VCF文件使用hg38版本的参考基因组。

优选地，为了在保障数据可靠性的前提下减少蛋白质数据库的冗余性而导致结果中的假阳性过高，本法发明还包括以下筛选步骤，即筛选出人群突变频率相对较高的高频突变。

优选地，本发明中筛选人群突变频率大于等于预设阈值的SNP位点，人群突变频率包括MAF或人群频率(allele frequency，AF)，本发明的预设阈值为0.005至1中的任意数。

进一步优选地，本发明的预设阈值为0.01，即筛选MAF≥0.01或AF≥0.01的SNP位点。

具体而言，在S201获取公共数据库的SNP位点信息的步骤中，选择人群突变频率大于预设阈值的数据信息。例如本发明中，以人群突变频率大于等于0.01为标准，优选地选择用dbSNP的common_all_20180418.vcf.gz文件。dbSNP数据库中提供了common_all_20180418.vcf.gz文件和ALL_20180418.vcf.gz,其中commoncommon_all_20180418.vcf.gz文件包含的SNP范围是所有常见人的突变位点清单，即MAF≥0.01。经过实验比较，发现在对同一数据使用ALL_20180418.vcf.gz来建库搜索时一方面会造成数据库的过度冗余，另一方面因为ALL_20180418.vcf.gz中大部分SNP都是低频突变(MAF＜0.01)，在对搜出的肽段进行FDR筛选时会导致FDR＝0.01时对应的谱图分数过高。dbSNP因为已经选用了common_all_20180418.vcf.gz文件，无需再对S202步骤筛选出的SNP位点列表进行频率的筛选。

或者，本发明在步骤S202筛选出的SNP位点列表中进一步筛选出人群突变频率相对较高的高频突变。具体而言，例如在选用的1000Genome数据库的数据中在VCF文件中添加对应的突变频率，并筛选出AF≥0.01的SNP，从而保证入选的每个SNP有较高的概率被检测到，避免因为一些较低频率的SNP导致数据库的过度冗余和假阳性过高。

筛选人群突变频率大于等于预设阈值的SNP位点使得能够从海量的数据信息中获取蛋白质突变频率较高的信息，这样的高丰度蛋白质信息使得后续建立的GVP参考蛋白质数据库的精度大大提高，从而提升了运行效率以及检索精度。

S3、根据样品的蛋白丰度筛选出表达量高的蛋白的SNP。

为了解决纳入过多的SNP位点可能会造成蛋白质数据库的高度冗余性，但随意去掉部分可能难以检测到的蛋白质序列又会导致在蛋白质数据库数据缺失的难点，本发明采用基于样品对SNP进行筛选的方式，即根据样品的蛋白丰度筛选出表达量高的蛋白的SNP。

具体而言，包括步骤：

S301、对样品质谱数据进行常规蛋白质组学分析得到蛋白定量信息。首先需要对样品的蛋白进分析。蛋白丰度的挑选依赖于样品的蛋白质组成，先通过对样品的常规蛋白质组学分析得到样品中包含的蛋白列表及其含量。

S302、根据蛋白定量信息，计算每个蛋白的总表达量，按表达量进行筛选，以得到基于样品的易被检测到的蛋白列表。筛选可以按蛋白丰度降序排序，挑选排序前n(n为正整数)的蛋白，或者预设蛋白丰度阈值，剔除低于阈值的蛋白质，从而得到基于样品的易被检测到的蛋白列表。具体的n或阈值需要根据实际样品决定。

S303、根据所述蛋白列表对SNP位点列表进行筛选，仅保留所述蛋白列表中对应蛋白的SNP位点信息。

由于本法明基于样品进行蛋白质丰度筛选，因此针对特定样品保障了结果可靠性，同时也避免了数据库的过度冗余和假阳性过高。

S4、生成挑选出的SNP位点列表对应的可遗传变异肽列表，根据公共蛋白质数据库生成基于样品的GVP参考蛋白质数据库。

进一步的，S4步骤包括以下步骤：

S401、对筛选出的SNP位点列表，利用对样品处理所用的酶，对SNP位点的原始蛋白质序列和突变后的蛋白质序列进行理论酶切，比较获得两者特异性的肽段，以生成可遗传变异肽(GVP)。

S402、下载公共蛋白质数据库的参考蛋白质序列，将不在参考蛋白质序列中的GVP添加到参考蛋白质序列中，以生成基于样品的GVP参考蛋白质数据库，所述GVP参考蛋白质数据库包括GVP列表中的所有GVP信息。

更进一步的，在判断GVP是否在公共蛋白质数据库中已经存在时，需要将异亮氨酸(氨基酸字母缩写I)替换为亮氨酸(氨基酸字母缩写L)，因为两者分子量相等，搜库软件搜索时无法鉴别。

优选地，将所述可遗传变异肽汇集为可遗传变异肽列表，所述可遗传变异肽列表中包括所述可遗传变异肽对应的SNP位点。

需要注意的是本发明的上述步骤的执行顺序并非固定，其中筛选人群突变频率大于等于预设阈值的SNP位点的步骤以及步骤S3也可以在步骤S401后执行，即获得GVP列表，再基于GVP列表进行进一步筛选。

S5、将S1步骤获取的质谱数据在本发明第一方面得到的参考蛋白序列数据库中进行搜库，得到匹配的肽段图谱对应的样品肽段列表。

进一步的，S5步骤包括：将S4步骤得到的GVP参考蛋白质数据库添加到数据库搜索引擎中，设定参数并将S1得到的质谱文件在GVP参考蛋白质数据库中进行搜库，导出搜库结果，计算错误发现率FDR(False Discovery Rates，FDR)，FDR被用以校正多重比较所致的误差，在拒绝多个零假设时，FDR校正程序能够控制错误拒绝零假设(假阳性)的可能性，来找到合适的结果组合。设置FDR＝0.01时对应的谱图的肽段谱图匹配得分为得分阈值，保留得分高于得分阈值的谱图，得到这些谱图对应的肽段列表即为样品肽段列表。

更进一步的，在将GVP参考蛋白质数据库添加到数据库搜索引擎之前，先将所有的异亮氨酸(氨基酸字母缩写I)替换为亮氨酸(氨基酸字母缩写L)，两者分子量相等，数据库搜索引擎无法鉴别。

S6、将样品肽段列表与S4步骤生成的GVP列表进行对比，以所述可遗传变异肽得到所述样品包含的SNP位点。

进一步的，S6步骤的具体操作为：将S5步骤得到样品肽段列表和S4步骤中的GVP列表进行对比，以得到样品的具体GVP信息，并通过GVP列表中对对应关系反推得到样品包含的SNP位点信息。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的适用于质谱鉴定的毛干蛋白质提取方法，在提取过程中，只需要加入一次增溶溶液，即可高效提取毛干蛋白，操作简便。

本发明所述的提取方法能够高效提取毛干样本中的蛋白质，在30min内即可快速消化毛干样本，缩短蛋白提取时间，提高提取效率，减少人力和时间的消耗，降低成本。

通过本发明的提取方法对样本进行高效的蛋白质提取，提取的蛋白数量多、杂质少，可以避免对质谱检测的影响，提高结果的准确性，尤其对于毛干样品数量较少时，可以有效提高后续检测的成功率。

本发明提取方法具有快速、准确、高特异性、高灵敏度的特点，可以有效克服采用毛干作为样品进行个体鉴定的问题，可以作为毛干样本在个体识别中推广应用，具有广阔的应用前景。

本发明提取方法操作简便，可以同时处理多个样本，具有高通量的特点。

本发明提供的超声处理装置，采用在换能器的相对端设置超声发生槽，从而将待处理混合物直接置于超声发生槽中进行超声处理，有效解决了现有的探针式超声破碎装置样品溅出、缠绕的问题，且超声强度高。

本发明采用质谱仪进行高灵敏度蛋白质组学检测，使用适用于色谱-质谱联用系统的毛细管分析柱，从而在样品提取蛋白质数量较少时也能准确检测质谱数据，灵敏度高，从而可以进一步用于SNP位点检测和个体鉴定，提高检测准确性。

本发明提供的基于毛干蛋白质组学测定SNP位点的方法，使用蛋白质组学检测样品的GVP反推SNP位点的检测方法，可以适用于所有未经测序来基于蛋白质组学进行的SNP检测。在无需对样品先测序分析的前提下利用蛋白质组学鉴定人的SNP位点信息，节省了测序和分析成本，克服了部分场合中难以获取核酸做测序的情况，可以在个体鉴定、法医辅助物证分析鉴定等方面发挥作用。以蛋白质作为SNP位点的研究对象，具有灵敏度高、稳定性高、检测通量高的优点。