用于人Galectin-3含量检测的ELISA荧光检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物
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，特别是涉及一种用于人Galectin-3含量检测的ELISA荧光检测试剂盒。背景技术
Galectin-3属于半乳糖苷凝集素家族。这个家族目前已有14个成员被报道，它们都至少拥有一个保守的结合半乳糖的糖识别结构域。Galectin-3是这个家族里比较特殊的一个，它由一个N端的类似胶原蛋白序列的无结构结构域和一个C端的糖识别结构域(CRD)组成。Galectin-3位于第14号染色体上，Galectin-3可以通过N端的结构域引导Galectin-3单体的聚合，形成自多聚体，或者和其他糖蛋白或糖脂形成多聚网格。N端结构域还可以辅助Galectin-3进入细胞核，通过6位丝氨酸的磷酸化，N端结构域可以影响CRD结构域对糖链的结合；Galectin-3也可以进入细胞核或线粒体等其他细胞器。
Galectin-3的C端CRD结构域是其行使糖链结合功能的结构域。CRD结构域可以与多种糖蛋白结合,进而影响这些靶蛋白的功能。比如Galectin3可以通过CRD结构域结合胰岛素受体,抑制下游的Akt磷酸化,进而抑制胰岛素受体的下游通路,导致胰岛素抵抗。Galectin-3也可以同EGFR，KRAS等蛋白结合，影响多种肿瘤的发展进程。
Galectin-3广泛表达于人体内多个组织中，但是其最主要的来源是巨噬细胞。Galectin-3可以被分泌到细胞外，进入血液循环中，并通过血液循环到达机体的各个部位。很多研究表明人血液中的Galectin-3含量和多种疾病相关。目前，Galectin-3已经被作为心脏衰竭的生物标记物。在其它多种疾病中，都发现在患者血液中Galectin-3的含量上升。比如，在胰腺癌中，血液中Galectin-3的含量联合CEA的含量可以更为有效的判断胰腺癌的发病程度。在宫颈癌、结肠癌、肝癌等癌症患者的血液中均可以发现Galectin-3表达水平的上调。因此，检测人血液中的Galectin-3含量对辅助判断一些病症具有重要意义。
目前，国内外已经有一些人Galectin-3ELISA检测试剂盒上市，但是都存在一定的缺点，比如：试剂盒k093758检测浓度范围为1.4-94.8ng/ml，并且在10ng/mL以下检测时误差较大；这个检测范围较大，在大部分疾病中，Galectin-3的血液浓度为5-15ng/mL之间，不适合检测。又如：R&D公司、abcam公司均有Galectin-3检测试剂盒，检测范围为0.16-10ng/mL，但是这些试剂盒采用吸光度检测方法，容易因为样品浓度超过10ng/mL而无法获得吸光度，不适合大规模的人血液样品检测。因此，亟需一种特异性强、适用范围广、精确度高并且操作简便的试剂盒，对于解决现有问题非常重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于人Galectin-3含量检测的ELISA荧光检测试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，该试剂盒采用双抗夹心法，以人Galectin-3特异性单抗作为捕获Galectin-3的抗体，可保证检测结果的特异性，同时还能减小试验误差。
本发明还有一个目的是提供一种ELISA荧光检测试剂盒在检测生物样品中Galectin-3含量方面的应用，利用该试剂盒可准确检测不同生物样品中Galectin-3含量，为临床医学提供数据支持。
本发明还有一个目的是提供一种ELISA荧光检测试剂盒检测生物样品中Galectin-3含量的方法，该方法简单易操作，可减少试验误差，提高试验结果的精确度。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种用于人Galectin-3含量检测的ELISA荧光检测试剂盒，包括:Galectin-3标准品、人血清Galectin-3阳性对照、Galectin-3捕获抗体包被的反应条板、抗Galecitn-3的特异性检测抗体、酶标二抗、生物样品稀释液、洗涤液以及荧光发光液。
优选的是,所述Galectin-3标准品为人Galectin-3。
优选的是,所述反应条板上包被的Galectin-3捕获抗体以及所述抗Galecitn-3的特异性检测抗体均不能与人Galectin-1、Galectin-2、Galectin-4、Galectin-7、Galectin-8和Galectin-10反应。
优选的是，所述酶标二抗为HRP标记的链霉亲合素。
优选的是，所述抗Galecitn-3的特异性检测抗体含有生物素标记，通过链霉亲合素-过氧化物酶放大信号，并通过荧光发光液检测信号。
优选的是,还包括酶标板，所述酶标板上包被有捕获人Galectin-3的特异性抗体。
本发明还提供一种所述的ELISA荧光检测试剂盒在检测生物样品中Galectin-3含量方面的应用，采用双抗夹心法进行人源Galectin-3含量的ELISA荧光检测。
优选的是，所述生物样品来源于细胞培养液、细胞裂解液以及人血浆或血清。
本发明还提供一种所述的ELISA荧光检测试剂盒检测生物样品中Galectin-3含量的方法，包括以下步骤：
步骤1：将Galectin-3捕获抗体包被在高吸附性酶标板上；
步骤2：将样品与抗Galectin-3的特异性检测抗体接触，形成Galectin-3:Galectin-3抗体复合物；
步骤3：检测样品中Galectin-3分子与抗体的结合情况；
步骤4：与对照样品比较，确定生物样品中Galectin-3的含量。
本发明公开了以下有益技术效果：
本发明所述的用于人Galectin-3含量检测的ELISA荧光检测试剂盒，具体采用双抗夹心法，以人Galectin-3特异性单抗作为捕获Galectin-3的抗体，保证了检测结果的特异性；随后以生物素标记的特异性多抗作为检测抗体，和链霉亲合素标记的辣根活氧化物酶形成抗体检测复合物，进一步排除了假阳性，形成一个4组分的夹心形状的结合物；最后加入ECL荧光发光液，将以上得到的正确信号有效放大，对比同步平行进行的标准品和内参实验，进一步排除实验中的试剂或操作误差，进而可以提高试验结果的精确度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1、人源Galectin-3ELISA检测标准曲线；
图2、人源Galectin-3血清样本ELISA检测板内样本稳定性的检测结果；
图3、细胞培养基上清中人源Galectin-3ELISA检测板内样本的稳定性的检测结果；
图4、细胞裂解液中人源Galectin-3ELISA检测板内样本的稳定性的检测结果；
图5、人源Galectin-3血清样本ELISA检测板间样本的稳定性的检测结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
ELISA试剂盒的组成与配置
1.1用于人Galectin-3含量检测的ELISA荧光检测试剂盒，包括:Galectin-3标准品、人血清Galectin-3阳性对照、Galectin-3捕获抗体包被的反应条板、抗Galecitn-3的特异性检测抗体、酶标二抗、生物样品稀释液、洗涤液、荧光发光液。
以下是各试剂的配制：
(1)Galectin-3标准品
Galectin-3蛋白溶解在0.01mol/L PBS溶液，pH7.4，0.1％BSA，Galectin-3终浓度为100μg/mL，使用时用标准品配制液稀释至20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL和0.3125ng/mL七个梯度。
(2)Galectin-3阳性对照样品
已知浓度的人血清。
(3)生物样品稀释液
血清稀释液，immunochemistry technology产品号649。
(4)标准品稀释液
在人血清和血浆样本的检测中，采用PBS稀释的20％FBS。
在细胞培养基上清样本检测中，采用细胞培养液。
在细胞裂解液样本检测中，采用细胞裂解液。
(5)抗体稀释液
将BSA溶于PBS溶液中,制备质量浓度为5％BSA。
(6)洗涤液(PBST)
8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,Tween-20 0.5mL，加双蒸水至800mL，调pH至7.4，定容至1L，配制成浓度0.01mol/L的PBST。
(7)Galectin-3抗体混合物
Galectin-3检测抗体来自R&D公司的BAF-1154，该抗体标记有生物素，工作浓度为50ng/mL；
HRP结合的链酶亲和素是R&D公司的DY998，工作浓度按1:200稀释，使用前用抗体稀释液配制并立即使用。
(8)ECL显色液
ECL显色液来自国产Tanon公司的ECL超敏试剂盒。
(9)酶标板
为预先抗体包埋和血清封闭好的白色酶标板，在超净工作台上风干后真空密封包装，使用时从密封袋内取出，剩余的酶标条放回密封袋内于4℃保存。
Galectin-3捕获抗体选用R&D公司的MAB-11541，单抗的终浓度为500ug/mL，使用时用包被液稀释至4ug/mL。
抗体包被液为0.05M NaHCO3/Na2CO3缓冲液，pH＝9.6，具体配制方法为：1.46gNaHCO3和0.75g Na2CO3溶解于500mL ddH2O中。包被液需要放于4℃冰箱内，一周以内使用。稀释抗体后，在酶标板中每孔加入60μL抗体，确保抗体铺满整个孔底。用封板膜封住，放入4℃冰箱中，包被14-16h。
取出酶标板，将剩余的抗体包被液甩干并在吸水纸上拍干。用洗涤液洗三遍，每次2min。用200μL PBS稀释的10％FBS封闭过夜。用洗涤液清洗四遍后除去洗涤液并风干。
1.2生物样本的制备
1.2.1人血清样本的制备
在选用1000g离心力、离心15min的条件对血清样品离心，所得到的血清样品立即分析；若不能马上使用，可将样品分装冻存，在-80℃保存。应该注意，所有血液组分应作为潜在的危险物来处理，同时避免对试剂瓶内样品的污染。
1.2.2细胞裂解液样本的制备
(1)培养细胞，细胞覆盖培养表面85％以上时，用PBS洗两遍后，吸干PBS；
(2)加入细胞抽提缓冲液(Cell Extraction Buffer)，细胞抽提缓冲液加入量依据细胞的量而定，两者比例关系为1×107个细胞加入1mL的细胞抽提缓冲液，用细胞刮收集细胞，转移至微量离心管内；
(3)冰浴10min后，用超声破碎仪破碎细胞，在混匀仪上4℃混匀10min，然后于13000rpm、4℃条件下离心10min，取上清即为细胞裂解液或细胞的蛋白质抽提液。细胞裂解液可存于-80℃，同时，在使用时应避免多次冻融循环。
细胞抽提缓冲液组成：50mM Tris，150mM NaCl，1mM EDTA，1％NP-40，蛋白酶抑制剂混合物磷酸酶抑制剂。需要注意的是：磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂使用前加入。
实验例1
采用ELISA试剂盒的组成与配置所述的ELISA荧光检测试剂盒检测生物样品中Galectin-3含量的方法，具体为：
(1)将待检血清样品、标准样、阳性对照样品放置在室温预先温度平衡后，用生物样品稀释液将血清样品作二分之一稀释(如遇到浓度非常高的样本，可以进行四分之一和八分之一稀释)；标准品稀释至20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.3125ng/mL七个梯度；直接选用标准品稀释液为阴性对照；
(2)在酶标板中加入100uL生物样品稀释液，将以上各样依次加入酶标板微孔中，每个样本2个重复实验，每孔50uL。25℃孵育3h，Galectin-3将与固相载体表面的捕获抗体—预先包被在孔内的抗体相结合。
(3)用抗体稀释液配制抗体复合物。Galectin-3检测抗体的终浓度为50ng/mL，HRP-链酶亲和素的稀释比例为1:200。除去微孔板内的样品，并在吸水纸上拍干。用PBST洗涤微孔板5次，在酶标板内加入新鲜配制的抗体复合物，每孔80μL。第二次孵育，25℃孵育2h。Galectin-3检测抗体可以结合第一次孵育中被捕获抗体结合的Galectin-3，HRP-链酶亲和素可以结合检测抗体上偶联的生物素，形成一个4组分抗原抗体复合物。
(4)用PSBT洗涤6次，洗去未结合的酶标二抗，加入ECL化学显色液，30s后在酶标仪上读取荧光强度的读数。
(5)荧光强度读数的高低和样品中Galectin-3的含量呈正相关，制作以标准品浓度为X轴、荧光强度值为Y轴的标准曲线(见图1)。
(6)计算样品中Galectin-3浓度：如果阳性对照样品的测定值和标示值相比较，其变异系数小于10％，说明测定过程可靠，可依据上一步骤得到的标准曲线计算所测样品中人源Galectin-3浓度。
实验例2
利用实验例1的ELISA荧光检测试剂盒检测生物样品中Galectin-3含量的方法，具体测定血清样本、细胞培养基上清、细胞裂解液不同来源人源Galectin-3的ELISA检测板内样本的稳定性，以及人源Galectin-3血清样本ELISA检测板间样本的稳定性。
3.1人源Galectin-3血清样本ELISA检测板内样本稳定性
通过实施例2的ELISA方法，在同一96孔板中平行检测样本20次，通过计算20次结果的平均值、标准差、CV获得板内血清样本检测的稳定性(如图2和表1所示)，结果显示板内不同血清样本中的人源Galectin-3稳定性高。
表1板内血清样本检测稳定性结果
3.2细胞培养基上清中人源Galectin-3ELISA检测板内样本的稳定性
用完全培养基(细胞培养基+10％FBS)配置人源Galectin-3标准品用于标准曲线制作。将人源Galectin-3溶于同一培养基中配置成高、中、低3个浓度梯度的Galectin-3检测样本，并在同一96孔板中平行检测样本20次。通过计算20次结果的平均值，标准差，CV获得板内细胞培养液样本检测的稳定性(如图3和表2所示)，结果显示检测的板内不同的细胞培养基上清液中人源Galectin-3稳定性高。
表2板内细胞培养基上清样本检测稳定性结果
3.3细胞裂解液中人源Galectin-3ELISA检测板内样本的稳定性
用细胞裂解液配置人源Galectin-3标准品用于标准曲线制作。收集细胞，用细胞裂解液重悬细胞，在4℃条件下温和混匀10min，使细胞充分裂解。将离心机预冷至4℃，12000rpm离心10min，除去细胞碎片。将上清液转移至干净的离心管中用于检测。如需必要，将裂解液稀释至标准曲线范围内。通过前文所述ELISA方法，在同一96孔板中平行检测样本20次。通过计算20次结果的平均值，标准差，CV获得板内细胞培养液样本检测的稳定性(如图4和表3所示)，结果显示不同细胞裂解液中人源Galectin-3的稳定性高。
表3板内细胞裂解液样本检测稳定性结果
4.人源Galectin-3血清样本ELISA检测板间样本的稳定性
通过实施例2的ELISA方法，独立检测样本20次，通过计算20次结果的平均值，标准差，CV获得板间血清样本检测的稳定性(如图5和表4所示)，结果显示板间不同血清样本来源的人源Galectin-3的稳定性高。
表4板间血清样本检测稳定性结果
以上平均值、标准差、CV％的计算公式如下：
平均值计算公式mean：
标准差计算公式：
CV计算公式：CV＝stdev/mean
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
