基于绿色荧光蛋白的真菌免疫调节蛋白细胞定位方法

文档序号：6333 发布日期：2021-09-17 浏览：123次英文

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种基于绿色荧光蛋白的真菌免疫调节蛋白细胞定位方法。

背景技术

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)最初是从水母中发现的一种蛋白质，当水母发光蛋白结合Ca²⁺后发出蓝色荧光，该蓝光进一步激发GFP产生绿色荧光。GFP激发后发出的荧光持续时间较长，且不需要任何其他辅助因子的作用，GFP的cDNA成功克隆及在大肠杆菌和哺乳动物细胞中成功表达后，人们认识到它巨大的应用前景。目前已经应用于蛋白表达、病原菌侵染监控和细胞定位等过程，是监测活细胞和组织内基因表达和蛋白质定位的理想探针。已被广泛地用作报告基因，进行活体的细胞学实验研究。

真菌免疫调节蛋白(fungal immunomodulatory protein,FIP)是分离于高等担子菌中一种具有免疫调节功能的小分子蛋白质。FIP家族的蛋白质具有抗肿瘤、抗过敏、刺激免疫细胞产生多种细胞因子等多种免疫调节作用，具有良好的药用保健价值和应用前景(Li QZ et al.,Fungal Immunomodulatory Proteins:Characteristic,Potential Anti-Tumor Activities and Their Molecular Mechanisms.Drug discovery today,2019,24:307-314.)。巨噬细胞属于单核吞噬细胞，能够产生大量的促炎性或抗炎性细胞因子，进而引起免疫应答,常被用作评价天然产物免疫调节活性的细胞模型。现有研究表明重组FIP-glu是一种潜在的小鼠腹腔巨噬细胞增殖和激活的刺激因子，能够在mRNA水平上调节巨噬细胞的促炎性和抗炎性介质，能够通过PI3K和MAPKs途径介导巨噬细胞的激免疫调节功能。(Li QZ,et al.,Immunomodulatory activity of Ganoderma lucidum immunomodulatoryprotein via PI3K/Akt and MAPK signaling pathways in RAW264.7 cells.J CellPhysiol.2019,234:23337-23348)。

探究真菌免疫调节蛋白对巨噬细胞的生物活性时，鉴定蛋白是否进入巨噬细胞发挥作用是首要步骤。现有的蛋白细胞定位方法主要有免疫荧光技术、免疫胶体金标记和融合报告基因等。免疫荧光技术是根据抗原与抗体反应原理，将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原。用这种方法虽然可以得到细胞中目的蛋白的大致分布情况，但是得到的图像是整个细胞中荧光信号的叠加，得不到较高的分辨率，不适用于细胞内蛋白定位的研究。免疫胶体金标记技术是利用胶体金在碱性环境中带负电的性质，使其与抗体相吸引，从而将抗体标记。这种方法可以非常精确地反映不同蛋白在细胞结构中的精确地位，但这种方法操作相当复杂，需要的时间和成本都很高。

融合报告基因的方法是将目的基因与gfp等易于监测的报告基因融合，利用目的基因的表达调控机制调控融合基因的表达，在荧光显微镜下监测融合蛋白在细胞内的存在状态。很多学者借助gfp构建融合载体进行亚细胞定位，如钟灵毓等以羊口疮病毒AH-F10株基因组为模板，构建了pEGFP::N1::ORFV127融合表达载体，利用GFP蛋白对ORFV127蛋白进行亚细胞定位(钟灵毓等.羊口疮病毒127基因的克隆表达及亚细胞定位分析.江苏农业学报,2019,35(03):646-652)。杨小理等用gfp构建了Adv::CerS2::GFP重组腺病毒，用激光共聚焦显微镜定位CerS2-GFP融合蛋白在肝癌细胞HepG2中的表达及细胞定位(杨小理等.人源CerS2重组腺病毒构建及其对肝癌细胞HepG2细胞周期的作用.重庆医学,2018,47(31):3978-3986)。

从现有的研究来看，gfp作为目前使用最广泛的细胞标记基因，能够有效的对融合蛋白进行细胞定位。经过对现有技术的检索，至今尚未发现利用GFP对真菌免疫调节蛋白(FIP)进行细胞定位的文献报道。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于绿色荧光蛋白的真菌免疫调节蛋白细胞定位方法，构建了GFP蛋白和FIP-glu蛋白的融合表达载体，将带有绿色荧光蛋白的FIP突变体在原核表达系统中进行表达并转入巨噬细胞RAW264.7，利用绿色荧光蛋白对真菌免疫调节蛋白进行细胞定位，能够准确、快速的鉴定出蛋白质是否进入细胞，为真菌免疫调节蛋白生物活性的探索提供了更加广阔的前景。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明通过克隆出包含如Seq ID No.1所示的绿色荧光蛋白基因的载体pUC57-GFP后，将其与pET-30a载体序列重组得到重组质粒pET-GFP，进一步与如Seq ID No.5所示的glu1基因序列重组得到重组质粒pET-glu1-GFP，再基于重组质粒构建pET-glu1-GFP原核表达菌株，经培养得到用于定位真菌免疫调节蛋白细胞的glu1-GFP重组蛋白。

所述的重组质粒pET-GFP的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

所述的重组质粒pET-GFP，优选经转入市售的大肠杆菌DH5α感受态细胞并通过菌落PCR以鉴定重组质粒准确性。

所述的重组质粒pET-glu1-GFP的核苷酸序列如Seq ID No.8所示。

所述的原核表达菌株为市售的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

所述的glu1-GFP重组蛋白，优选经过纯化处理。

所述的定位真菌免疫调节蛋白细胞是指：通过包含glu1-GFP重组蛋白的培养基对真菌免疫调节蛋白细胞进行培养，使得包含荧光的glu1-GFP重组蛋白进行真菌免疫调节蛋白细胞。

所述的真菌免疫调节蛋白细胞，采用但不限于巨噬细胞。

所述的定位方法具体包括：

步骤1)根据绿色荧光蛋白的基因序列，设计合成绿色荧光蛋白基因，将基因克隆在pUC-57载体中，得到pUC57-GFP；

步骤2)根据绿色荧光蛋白和pET-30a载体基因序列，用BamH I和Not I酶切pUC57-GFP和pET-30a载体质粒，将酶切产物连接，获得重组质粒pET-GFP，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞；

步骤3)用引物T7和T7t对重组质粒pET-GFP进行菌落PCR鉴定重组质粒准确性；

步骤4)根据pET-GFP重组载体序列和glu1基因序列，用Nde I和BamH I酶切pET-GFP重组载体和glu1基因，将酶切产物连接，获得重组质粒pET-glu1-GFP；

步骤5)将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，构建pET-glu1-GFP大肠杆菌原核表达菌株；

步骤6)将大肠杆菌阳性单克隆菌落在LB^Kan液体培养基中培养，获得rFIP-glu1-GFP重组蛋白并纯化；

所述的LB^Kan液体培养基的含量组分为：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，卡那霉素(Kan)25μg/mL。

步骤7)对rFIP-glu1-GFP重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting检测。

步骤8)用rFIP-glu1-GFP重组蛋白处理巨噬细胞，在荧光显微镜下观察重组蛋白，进行细胞定位。

技术效果

本发明整体解决了通过绿色荧光蛋白与真菌免疫调节蛋白的融合表达在以各类免疫细胞或肿瘤细胞进行实验时实现蛋白的细胞定位的技术问题。

与现有技术相比，本发明得到带有绿色荧光蛋白标记的真菌免疫调节蛋白FIP-glu1-gfp(LZ-8)的原核表达菌株，直接解决后续各类FIP活性实验中该蛋白在细胞中定位的要求。

附图说明

图1为质粒pET-30a和GFP酶切电泳图；

图中：(A)质粒pET-30a酶切电泳图，泳道M：DNA Marker DL 15,000；泳道1：质粒pET-30a酶切后；泳道2：质粒pET-30a酶切前；(B)重组质粒pUC57-GFP酶切电泳图，泳道1：重组质粒pUC57-GFP酶切前；泳道2：重组质粒pUC57-GFP酶切后；箭头所示GFP基因；

图2为重组质粒pET-GFP菌落PCR电泳图；

图中：泳道M：DNA Marker DL 2,000；泳道1～9：含有重组质粒pET-GFP大肠杆菌转化子的检测结果；泳道﹣：阴性对照，

图3为重组质粒pET-glu1-GFP的构建流程图；

图4为FIP-glu1(LZ-8)基因的克隆电泳图；

图中：泳道M：DNA Marker DL 2,000；泳道1：FIP-glu1(LZ-8)基因；泳道﹣：阴性对照，

图5为重组质粒pET-GFP酶切电泳图；

图中：泳道M：DNA Marker DL 15,000；泳道1：重组质粒pET-GFP酶切前；泳道2：重组质粒pET-GFP酶切后；

图6为重组质粒pET-glu1-GFP菌落PCR电泳图；

图中：菌落PCR检测，泳道M：DNA Marker DL 2,000；泳道1～12：含有重组质粒pET-glu1-GFP大肠杆菌转化子的检测结果；泳道﹣：阴性对照

图7为glu1-GFP蛋白SDS-PAGE和Western blotting检测图；

图中：(A)大肠杆菌转化子SDS-PAGE检测，泳道M：蛋白质标准分子量；泳道1：未经IPTG诱导的大肠杆菌转化子总蛋白；泳道2～5：经IPTG诱导的大肠杆菌转化子总蛋白，(B)纯化的重组glu1-GFP蛋白检测，泳道M：蛋白质标准分子量；泳道1：纯化的重组glu1-GFP蛋白SDS-PAGE检测；泳道2：纯化的重组glu1-GFP蛋白Western blotting检测，

图8为重组glu1-GFP细胞定位图；

图中：(A)可见光下glu1-GFP处理细胞照片；(B)紫外光下glu1-GFP处理细胞照片。

具体实施方式

本实施例涉及一种基于绿色荧光蛋白的真菌免疫调节蛋白细胞定位方法，包括以下步骤：

步骤1)构建pET-GFP重组质粒

以Linker和GFP的氨基酸序列为蓝本，合成Linker+GFP基因序列(于上海生工生物工程股份有限公司合成)，合成序列如Seq ID No.1所示，基因克隆在pUC-57载体中，得到pUC57-GFP。提取原核表达载体pET-30a和pUC57-GFP，利用限制性内切酶BamH I和Not I进行双酶切。如图1所示，质粒pET-30a经酶切后为单一条带，大小约为5,390bp，与预期一致。pUC57-GFP基因经双酶切后产生两条条带，较大的条带为线性化的载体pUC-57，较小的条带为GFP，大小为779bp，与预期一致。

用T4 DNA连接酶将pET-30a与GFP连接，构建成重组质粒pET-GFP，并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。经LB^Kan固体培养基筛选后，分别挑取若干菌落进行菌落PCR检测，PCR反应程序为：94℃5min，(94℃30s，55℃1min，72℃40s)35cycles，72℃10min；PCR采用的引物序列为T7和T7t，分别如Seq ID No.3和如Seq ID No.4所示。

所扩增的基因片段应为1,107bp。结果如图2所示，泳道1、2、3、5、7、8和9在相应位置均具有特异性条带。经上海生工生物工程股份有限公司测序，结果显示序列正确。表明重组质粒pET-GFP构建成功。

步骤2)构建rFIP-glu1-GFP重组质粒

如图3所示，构建原核表达载体pET-glu1-GFP。如图4所示，glu1经PCR扩增后，在约400bp处有单一条带出现，大小与预期一致。PCR扩增反应程序为：94℃5min，(94℃30s，55℃1min，72℃40s)35cycles，72℃10min；PCR采用的引物序列分别如Seq ID No.6和如Seq IDNo.7所示。

提取重组质粒pET-GFP。将重组质粒和PCR纯化产物经限制性内切酶Nde I和BamHI双酶切。由于PCR产物经双酶切后仅减少数个碱基，无法在琼脂糖凝胶电泳上观察到酶切前后的变化，故未给出电泳图。图5所示，重组质粒pET-GFP经酶切后为单一条带，大小为6016bp，与预期一致即如Seq ID No.2所示。回收相应条带后，经T4 DNA连接酶连接，构建成重组质粒pET-glu1-GFP，并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。经LB^Kan固体培养基筛选后，分别挑取若干菌落进行菌落PCR检测，所扩增的基因片段应为1,323bp。PCR反应程序为：94℃5min，(94℃30s，55℃1min，72℃40s)35cycles，72℃10min；PCR采用的引物序列为T7和T7t，分别如Seq ID No.3和如Seq ID No.4所示。结果如图6所示，12个样本在相应位置均具有特异性条带。经测序，结果显示序列正确即如Seq ID No.8所示。表明重组质粒pET-glu1-GFP构建成功。

步骤3)rFIP-glu1-GFP蛋白的表达与纯化

将重组质粒pET-glu1-GFP转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购于上海生工生物工程股份有限公司)，经IPTG诱导后，将所产蛋白进行10％SDS-PADE和Westernblotting检测。SDS-PAGE检测参照宝日医(TaKaRa)生物技术(北京)有限公司网站所提供的方法配制SDS-PAGE凝胶，以80V电压进行电泳，待样品迁移至分离胶，以120V电压进行电泳，直至结束；Western blotting检测用半干法进行，一抗为小鼠抗6×His单克隆抗体，二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG。检测结果如图7所示，样品在约40kD位置处出现特异性条带，即重组FIP-glu1(LZ-8)和GFP的融合蛋白，简称为glu1-GFP。用3.5kD透析袋对发酵液上清进行透析，将透析袋内液冷冻干燥后用Lysis Buffer溶解，用His60 Ni Superflow Resin柱(购于上海生工生物工程股份有限公司)进行纯化，纯化后的洗脱液经3.5kD透析袋透析，将透析袋内液冷冻干燥，溶于PBS。

步骤4)rFIP-glu1-GFP蛋白的细胞定位

用PBS洗涤巨噬细胞RAW264.7后，经胰酶消化，将细胞悬浮于DMEM细胞培养基(GEHealthcare Life Sciences，HyClone^TM)，对细胞计数，以2×10⁵个/mL的浓度将细胞接种于新的含有DMEM培养基的细胞培养瓶，置于CO₂培养箱于37℃培养中。2×10⁵个/孔的浓度将细胞接种于12孔、24孔或96孔细胞培养板，培养24h，弃去培养基，添加含有重组glu1-GFP的培养基，继续培养24h。用荧光显微镜观察细胞，结果如图8所示，表明重组glu1-GFP进入了巨噬细胞内部。

本方法利用蛋白融合表达构建带有标记的蛋白原核表达菌株，直接生产出能进行细胞定位的真菌免疫调节蛋白。与现有技术相比，本方法通过GFP与FIP-glu1的融合表达构建直接生产出带有荧光标记的真菌免疫调节蛋白，从而更加方便地得到真菌免疫调节蛋白细胞定位结果。

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 基于绿色荧光蛋白的真菌免疫调节蛋白细胞定位方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 779

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatccggcg gtggtggttc tggtggtggt ggttccggtg gtggtggttc catggtttct 60

aagggtgagg agctgtttac cggtgtcgtc cctattctgg ttgagttgga cggtgacgtt 120

aacggtcaca agttctccgt ttctggagag ggtgagggtg acgctaccta cggtaagttg 180

accttgaagt tcatttgcac caccggaaag ttgccagtgc cttggccaac cttggttacc 240

accttgacct acggagttca gtgttttagc agataccctg accacatgaa gcagcacgat 300

ttcttcaagt ccgctatgcc agaaggctac gtccaagagc gtactatctt cttcaaggac 360

gacggtaact acaagactag agctgaggtc aagtttgagg gtgataccct ggttaacaga 420

atcgagttga agggtattga cttcaaagag gatggtaaca ttttgggtca caagctggag 480

tacaactaca actcccacaa cgtttacatt atggcagaca agcaaaagaa cggtatcaag 540

gtcaacttca agatcagaca caacatcgag gacggtagcg tccaactggc cgatcactac 600

caacaaaaca ccccaatcgg tgacggacct gtcctgttgc cagacaacca ctacttgtcc 660

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ttcgtcactg ccgctggtat tactttgggt atggacgagt tgtacaagta agcggccgc 779

<210> 2

<211> 6162

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt 5580

tgatgctcga tgagtttttc taagaattaa ttcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 5640

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aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac cgagataggg 5820

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taatacgact cactataggg 20

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctagttatt gctcagcgg 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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attagctgct ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc 120

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