一种羧基二羟鬼笔毒肽时间分辨荧光免疫检测卡、制备及检测方法与应用
技术领域
本发明涉及多肽检测
技术领域
，具体地说，涉及一种羧基二羟鬼笔毒肽时间分辨荧光免疫检测卡、制备及检测方法与应用。背景技术
毒蘑菇中毒是食物中毒事件中导致死亡的主要原因之一。90％以上的蘑菇中毒死亡是由含鹅膏肽类毒素的蘑菇引起，鬼笔毒肽类是鹅膏肽类毒素的一种，为双环七肽，已发现的有7种，结构相似。羧基二羟鬼笔毒肽(Phallacidin,PCD)为其中一种，并占主要成分，与鹅膏毒肽一起存在，对小鼠的致死剂量是50μg，对人体也有很强的毒性，中毒后使动物或人的肝脏受损，可引起流涎、呕吐、便血、发绀、痉挛、肌肉挛缩，以致死亡。它同细胞松弛素的作用相反，只与聚合的微丝结合，而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后，抑制了微丝的解体，因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。
目前，尿液中羧基二羟鬼笔毒肽残留含量的主要检测方法为色谱方法，如气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)等。色谱方法一般需要昂贵的检测仪器，且存在前处理复杂，操作繁琐，检测时间长，检测成本高的问题，所以色谱方法也不适用于基层实验室大批量样本的检测。
时间分辨荧光免疫分析技术(Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是以镧系元素(包括Eu、Tb、Sm、Dy等)作为标记物，综合免疫反应的高特异性和镧系元素标记的高灵敏性相结合而建立的一种新型非放射性免疫检测技术。镧系元素具有Stokes位移大(>200nm)和荧光寿命长(1-2ms)的优点，可以在最大程度上避免和激发光和背景荧光信号的干扰，极大地提高了检测灵敏度。鉴于其上述特点，TRFIA已广泛应用于临床诊断，以及食品安全检测等多个领域。但目前尚未应用到羧基二羟鬼笔毒肽的检测中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可快速、灵敏检测羧基二羟鬼笔毒肽的检测卡、方法及应用。
为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
一种羧基二羟鬼笔毒肽时间分辨荧光免疫检测卡，其包括底板和放置在所述底板上的样品垫、含有铕微球标记的抗羧基二羟鬼笔毒肽抗体的释放垫、含有羧基二羟鬼笔毒肽检测线T以及质控线C(控制线)的硝酸纤维素膜和吸水垫。
本发明中，所述抗羧基二羟鬼笔毒肽抗体为抗羧基二羟鬼笔毒肽单克隆抗体。
本发明中，所述含有铕微球标记的抗羧基二羟鬼笔毒肽抗体的释放垫为将铕微球标记的抗羧基二羟鬼笔毒肽抗体溶液喷于释放垫上形成的；
所述铕微球标记的抗羧基二羟鬼笔毒肽抗体溶液的浓度为0.1mg/mL。
本发明中，所述铕微球标记的抗羧基二羟鬼笔毒肽抗体溶液中，所述抗羧基二羟鬼笔毒肽抗体和铕微球的质量比为1：25；
和/或，所述铕微球为200nm羧基化铕微球。
本发明中，所述羧基二羟鬼笔毒肽检测线T由羧基二羟鬼笔毒肽抗原或其溶液形成；
和/或，所述质控线C由IgG抗体或IgG抗体溶液形成；
和/或，所述含有羧基二羟鬼笔毒肽检测线T以及质控线C的硝酸纤维素膜为将羧基二羟鬼笔毒肽抗原溶液包被在硝酸纤维素膜形成检测线T，且将IgG抗体溶液包被在硝酸纤维素膜形成质控线C，得到含有羧基二羟鬼笔毒肽检测线T以及质控线C的硝酸纤维素膜；
优选，所述羧基二羟鬼笔毒肽抗原溶液的包被浓度为0.4mg/mL；
和/或，所述IgG抗体溶液的包被浓度为1.0mg/mL。
本发明还提供一种制备上述检测卡的方法，包括如下步骤：先制备含有铕微球标记的抗羧基二羟鬼笔毒肽抗体的释放垫和含有羧基二羟鬼笔毒肽检测线T以及质控线C的硝酸纤维素膜；再将样品垫、所述含有铕微球标记的抗羧基二羟鬼笔毒肽抗体的释放垫、所述含有羧基二羟鬼笔毒肽检测线T以及质控线C的硝酸纤维素膜和吸水垫组装到底板上，得到检测卡。
本发明另提供一种上述检测卡在以下方面的应用：
(1)在制备定量或定性检测或辅助检测羧基二羟鬼笔毒肽产品中的应用；
(2)在定量或定性检测或辅助检测羧基二羟鬼笔毒肽中的应用。
上述检测卡中的铕微球标记的抗羧基二羟鬼笔毒肽抗体在检测或辅助检测待测样品中是否含有羧基二羟鬼笔毒肽或待测样品中羧基二羟鬼笔毒肽含量中的应用也是本发明的保护范围。
本发明还提供一种检测或辅助检测待测样品中是否含有羧基二羟鬼笔毒肽的方法，包括如下步骤：将待测样品加入上述检测卡的样品垫上，反应，再用荧光免疫定量分析仪检测反应的产物；
若所述检测卡的检测线T荧光信号值小于等于质控线C荧光信号值，则待测样本中含有或候选含有羧基二羟鬼笔毒肽；
若所述检测卡的检测线T荧光信号值大于质控线C荧光信号值，则待测样本中不含有或候选不含有羧基二羟鬼笔毒肽。
一种检测或辅助检测待测样品中羧基二羟鬼笔毒肽含量的方法，包括如下步骤：
(1)制备标准曲线：取与待测样品同样来源且羧基二羟鬼笔毒肽含量小于0.1μg/L的样本；
再向所述样本中加入不同浓度的羧基二羟鬼笔毒肽，得到不同浓度的标准品溶液；
再将所述不同浓度的标准品溶液加入上述检测卡的样品垫上，反应，再用荧光免疫定量分析仪检测反应的产物，得到不同浓度的标准品溶液的检测线T荧光信号值与质控线C荧光信号值；
以添加的羧基二羟鬼笔毒肽不同浓度为X轴，不同浓度对应的检测线T荧光信号值与质控线C荧光信号值的比值为Y轴，绘制标准曲线；
(2)将所述待测样本加入上述检测卡的样品垫上，反应，再用荧光免疫定量分析仪检测反应的产物，得到待测样本的检测线T荧光信号值与质控线C荧光信号值；
将所述待测样本的检测线T荧光信号值与质控线C荧光信号值代入步骤(1)得到的标准曲线中，得到待测样本中羧基二羟鬼笔毒肽的含量。
上述应用或方法中，所述待测样本为尿液、血浆或血清样本。
本发明的有益效果至少在于：
本发明利用铕微球作为抗体标记物，建立了一种简单、快速、高灵敏的样品中羧基二羟鬼笔毒肽残留的荧光定量免疫层析检测方法，并对所建立方法的灵敏度，准确性和精密度的指标进行评价，提供了一种适用于羧基二羟鬼笔毒肽痕量残留的快速检测方法。
本发明使用镧系元素铕(365/610nm，λex/λem)的羧基微球作为抗体标记物建立免疫层析方法。铕元素具有较大的Stokes位移(>200nm)，因此检测过程中激发的信号不会对发射光的荧光信号造成干扰；另外，镧系元素的荧光寿命相对比较长，可达1-2ms，故而可待其它荧光信号消失之后再行检测，以达到降到背景信号干扰的目的。上述两个方面的优势极大地提高了本发明时间分辨荧光免疫分析方法的灵敏度。
本发明方法的检测灵敏度(定量限0.1μg/kg)达到了仪器方法的灵敏度水平；该方法中羧基二羟鬼笔毒肽的添加回收率(88.8％-97.2％)和变异系数(3.5％-8.6％)均能满足检测要求。因此，本发明建立的时间分辨荧光免疫层析方法在羧基二羟鬼笔毒肽检测工作中具有较高应用价值和应用前景。
附图说明
图1为本发明的时间分辨荧光免疫快速检测卡结构示意图。
图2为尿液样本中PCD添加梯度检测结果图。
图3为TRFICA检测尿液中PCD标准曲线结果图。
图4为TRFIA与HPLC检测结果线性相关图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
具体下述实施例中部分材料如下:
微量移液器(德国Eppendorf)、冷冻离心机(德国Thermo Fisher Scientific)、超声波清洗仪KQ-100E(昆山市超声仪器有限公司)、高效液相色谱-串联质谱仪(美国ThermoFisher Scientific公司)；检测卡恒温孵育器(WH-400)和时间分辨荧光免疫定量分析仪(FQ-S2，365/610nm)由维德维康生物技术有限公司研制。
200nm羧基化铕微球(365/610nm,λex/λem)购自美国Creative Diagnostics公司；硝酸纤维素膜(NC膜)购自美国Millipore公司；样品垫、吸收垫、PVC底板均购自上海良信科技有限公司。
羧基二羟鬼笔毒肽标准品购自美国Sigma公司，标准品溶液配制：准确称取1.0mg羧基二羟鬼笔毒肽标准品，用甲醇溶解并定容至1mL，配制成1mg/mL的标准品溶液，于-20℃保存，备用。
抗羧基二羟鬼笔毒肽单克隆抗体为本实验室制备，制备过程为：利用活泼酯法将羧基二羟鬼笔毒肽与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)偶联合成免疫原PCD-KLH和PCD-BSA，与卵清白蛋白(OVA)偶联合成包被原PCD-OVA。将免疫原稀释成1mg/mL，与弗氏完全佐剂等体积混合后进行乳化，于颈背部多点注射免疫Balb/c小鼠，每次免疫剂量为0.2mL/只。间隔三周后进行加强免疫，改用弗氏不完全佐剂。第三次加强免疫结束后1周，小鼠眼眶采血，采用icELISA方法检测抗血清水平。选择效价高，抑制好的小鼠制备脾细胞悬液。将脾细胞与SP2/0细胞按照5:1的比例混合，利用PEG进行融合。采用有限稀释法筛选特异性杂交瘤细胞克隆，并采用腹水诱生法制备单克隆抗体。将获得的单克隆抗体于-20℃保存，备用。
羊抗鼠二抗由北京维德维康生物技术有限公司获得。尿液空白样本由20名志愿者提供。
实施例1羧基二羟鬼笔毒肽时间分辨荧光免疫快速检测卡的制备及检测方法的建立
一、羧基二羟鬼笔毒肽时间分辨荧光免疫快速检测卡的的制备
1、羧基化铕微球的抗体标记
本实施例在200nm羧基化时间分辨，抗体标记方法的基础之上，进行了优化。具体标记方法如下：
①50μL羧基化铕微球(200nm羧基化铕微球(365/610nm，λex/λem)；浓度：1％)中加入450μL活化缓冲液(0.05mol/L MES，pH 5.0)，超声5min；②然后，向①处理后的溶液中依次加入EDC和NHS使其终浓度为分别为0.1mM和0.2mM，室温振荡反应30min，15000g离心10min，弃去上清液；③将②得到的沉淀用500μL偶联缓冲液(0.04mol/L PB，pH 8.0)复溶，超声5min，加入10μL 5mg/mL羧基二羟鬼笔毒肽单克隆抗体，室温振荡反应2h，15000g离心5min；④向③得到的沉淀中加入500μL封闭缓冲液(0.01mol/L PB，2％BSA，pH 8.0)，4℃振荡反应过夜；⑤将④得到的反应液以15000g离心5min，弃去上清，加入500μL的Tris-HCl(1％BSA，0.5％Tween-20，0.02％Proclin-300，pH 7.0)复溶沉淀，超声5min，4℃避光保存备用，得到羧基化铕微球标记的羧基二羟鬼笔毒肽单抗(浓度为0.1mg/mL)。
2、羧基二羟鬼笔毒肽时间分辨荧光免疫快速检测卡的组装
用划膜仪将羧基二羟鬼笔毒肽抗原(2.0mg/mL，1:5稀释)和羊抗鼠IgG(20mg/mL，1:20稀释)包被于NC膜上分别作为检测线(T线，0.7μL/cm，羧基二羟鬼笔毒肽抗原包被浓度为0.4mg/mL)和质控线(C线，0.7μL/cm，羊抗鼠IgG包被浓度为1.0mg/mL)，置于37℃烘箱中过夜干燥，得到含有羧基二羟鬼笔毒肽检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜。
将上述步骤1制备的羧基化铕微球标记的羧基二羟鬼笔毒肽单抗喷于释放垫(上海金标生物科技有限公司，SB08，300*200mm)上，喷量为3.0μL/cm，置于37℃烘箱中干燥2h，得到含有铕微球标记的抗羧基二羟鬼笔毒肽抗体的释放垫。
然后，将样品垫、含有铕微球标记的抗羧基二羟鬼笔毒肽抗体的释放垫、含有羧基二羟鬼笔毒肽检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜、吸水垫(上海金标生物科技有限公司，CH37，300*46mm)依次粘于PVC底板上，并用切割机切成3.95mm宽度的试纸条，得到羧基二羟鬼笔毒肽时间分辨荧光免疫快速检测卡，其结构如图1所示。
二、羧基二羟鬼笔毒肽时间分辨荧光免疫快速检测卡检测方法的建立
1、羧基二羟鬼笔毒肽时间分辨荧光免疫快速检测卡定性检测方法的建立
取100μL样本待测液滴加至上述制备的羧基二羟鬼笔毒肽时间分辨荧光免疫快速检测卡(图1)的样本垫上，40℃检测卡恒温孵育器中准确反应5min后，取出并使用荧光免疫定量分析仪检测。
若检测线T荧光信号值小于等于质控线C荧光信号值，则待测样本中含有或候选含有羧基二羟鬼笔毒肽；
若检测线T荧光信号值大于质控线C荧光信号值，则待测样本中不含有或候选不含有羧基二羟鬼笔毒肽。
2、羧基二羟鬼笔毒肽时间分辨荧光免疫快速检测卡定量检测方法的建立
1)标准曲线的绘制
取尿液阴性样品7份(每份500mL)，向其中添加羧基二羟鬼笔毒肽标准溶液使其终浓度分别为：0.0μg/L，0.1μg/L，0.3μg/L，0.9μg/L，2.7μg/L，8.1μg/L和24.3μg/L充分混匀后，按照上述1中的方法进行样本提取，得到各个浓度样本的提取液。
将上述各个浓度尿液样本按照上述1进行检测。每个浓度重复检测5次，取平均值。以样本中添加的羧基二羟鬼笔毒肽终浓度为X轴，检测线T荧光信号值与质控线C荧光信号值的比值(T/C)为Y轴，用origin8.0(OriginLab Corp.,Northampton,MA,USA)做非线性拟合分析，形成四参数拟合曲线如下所示：
Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D；
通过测试数据的拟合表明，所建立的尿液中羧基二羟鬼笔毒肽时间分辨荧光免疫层析定量检测方法的标准曲线为：
Y＝(0.91–0.014)/[1+(X/0.93)^1.57]+0.014(R2＝0.995)；
^表示次方，如(X/0.93)^1.57表示(X/0.93)的1.57次方。
其中，X为羧基二羟鬼笔毒肽浓度值，Y为T/C值(图2和图3)。
2)检测
取100μL尿液样本滴加至上述制备的羧基二羟鬼笔毒肽时间分辨荧光免疫快速检测卡中的样本垫上，40℃检测卡恒温孵育器中准确反应5min后，取出并使用荧光免疫定量分析仪检测，得到T线荧光信号值与C线荧光信号值。
将上述T线荧光信号值与C线荧光信号值的比值代入上述标准曲线中，得到样本中羧基二羟鬼笔毒肽含量。
三、羧基二羟鬼笔毒肽时间分辨荧光免疫快速检测卡的最低检测限
取尿液空白样品20份，按照上述二中的2的方法检测上述20份空白样品中的羧基二羟鬼笔毒肽含量。计算20份空白样品中的羧基二羟鬼笔毒肽含量的平均值和标准差：平均值加上3倍标准差，即为定量限。
结果如表1所示，可以看出，依据20个样本的所测平均值和标准差计算得到该方法对尿液样本中羧基二羟鬼笔毒肽的定量检测限为0.12μg/L。
表1尿液空白样品的羧基二羟鬼笔毒肽测定结果(μg/L)
四、准确度和精密度
取尿液空白样品3份，分别加入羧基二羟鬼笔毒肽溶液，并使其终浓度为0.5μg/L、1.0μg/L和2.0μg/L，每个浓度梯度添加5个平行。
按照上述二的方法检测，最后，依据添加回收数据对所建立时间分辨荧光免疫层析定量分析方法的准确度和精密度进行分析。
结果如表2所示，羧基二羟鬼笔毒肽的添加回收率为88.8％-97.2％，变异系数3.5％-8.6％，表明该方法具有较好的准确度和精密度。
表2准确性和精密度实验结果(μg/L)
添加浓度
平均值(n＝5)
标准差
回收率(％)
变异系数(％)
0.5
0.486
0.017
97.2
3.5
1.0
0.888
0.076
88.8
8.6
2.0
1.786
0.134
89.3
7.5
回收率＝(平均值/添加浓度)×100％
变异系数＝(标准差/平均值)×100％；
五、羧基二羟鬼笔毒肽时间分辨荧光免疫快速检测卡检测与HPLC检测结果比较
取尿液空白样品4份，分别加入羧基二羟鬼笔毒肽溶液，并使其终浓度为0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L和4.0μg/L，每个浓度梯度添加5个平行。
将样本采用本发明的方法(TRFIA)检测，且同时采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)进行检测，并对两种方法检测结果的一致性进行分析。
测试结果如图4所示。上述两种方法检测结果的线性相关方程为：Y＝-0.05+0.98X，相关系数R2＝0.971。由此可知，两种方法对尿液中羧基二羟鬼笔毒肽检测结果一致性较高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
