一种工程化外泌体纳米马达及其制备方法
技术领域
本发明属于新型生物纳米材料，具体涉及一种工程化外泌体纳米马达及其制备方法。
背景技术
外泌体是一种能被机体内许多类型细胞分泌的细胞外囊泡，直径大约分布在30-150nm，并分布于各种体液中。外泌体因其含有母体细胞中大多数的生物信息(micro RNAs、蛋白质和脂质等)，并能够通过细胞膜融合将这些信息传递给受体细胞。这种全新的细胞间信息传递系统参与了不同细胞间的信息传递，调节细胞间的信号传导，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。
具有良好生物相容性的外泌体，具备体内循环时间长、靶向病灶部位、修复受损部位等优点，从而可作为良好的药物递送载体。然而，面对复杂多变的疾病病理机制，单纯的外泌体在作为药物载体使用时因缺乏主动运动能力，未能实现在病患深处的药物递送，从而造成治疗效果不够理想，因此需要对其进行工程化以赋予其自主运动能力。
一氧化氮(NO)纳米马达基于人体内源性生化反应，在体内一氧化氮合成酶的作用下将活性氧和L-精氨酸转化为驱动气体一氧化氮。除作为驱动气体外，一氧化氮还具有增强组织渗透性、促进血管内皮化和提高抗癌效率等作用，具有潜在生物医学应用。更为重要的是，基于自主运动的一氧化氮纳米马达利用病患炎症部位或高ROS浓度的微环境较好实现在病症部位的靶向与聚集。若能将此类NO驱动基体修饰至外泌体表面，则有望赋予外泌体自主运动能力实现患病部位的深度治疗，从而提高治疗效果。目前还未有利用纳米马达技术对外泌体进行工程化的报道。因此，亟需新技术开发制备出一种工程化外泌体纳米马达。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种工程化外泌体纳米马达，本发明的工程化外泌体纳米马达可以有效实现外泌体精准靶向的靶向病灶部位、修复受损部位，使得外泌体在作为药物载体实现在病患深处的药物递送，赋予其自主运动能力。
本发明还提供一种工程化外泌体纳米马达的制备方法。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种工程化外泌体纳米马达，所述工程化纳米马达由表面巯基化的一氧化氮(NO)驱动基体通过水溶性交联剂对外泌体进行表面工程化修饰形成。本发明中的工程化修饰为通过物理与化学手段将具有一些特定功能的物质修饰到外泌体，形成一种工程化的外泌体﹐协同外泌体自身发挥更多的功能。在本发明中是通过交联剂，将NO纳米马达修饰到外泌体。
其中，所述一氧化氮驱动基体为共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物或负载L-精氨酸的碗状介孔硅纳米材料。
其中，所述共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物主要由甲基丙烯酸酐与L-精氨酸反应形成单体，在引发剂引发下与交联剂聚合形成的精氨酸单体；所述交联剂为含有二硫键的双键交联剂，具体可为N,N'-双丙烯酰胱胺等；所述引发剂为水溶性引发剂，如偶氮二异丁脒盐酸盐等。
其中，所述负载L-精氨酸的碗状介孔硅纳米材料作为一氧化氮(NO)驱动基体以CTAB为模板剂，浓氨水为催化剂，乙醇为助溶剂的混合体系中，双(γ-三乙氧基硅基丙基)四硫化物和正硅酸乙酯的混合前驱体进行脱水缩合，并在氢氧化钠的刻蚀作用下，形成碗状介孔二氧化硅；所述负载L-精氨酸方法主要利用介孔限域效应，由碗状介孔二氧化硅在高浓度的精氨酸溶液进行物理吸附得到负载L-精氨酸的碗状介孔硅纳米材料马达。
作为优选，所述水溶性交联剂为马来酰亚胺交联剂，如4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐。
其中，所述外泌体的来源包括干细胞、癌细胞或者巨噬细胞等，其提取方法包括差速离心法或试剂盒提取法。
本发明所述的工程化外泌体纳米马达的制备方法，包括如下步骤：
(1)将一氧化氮驱动基体进行巯丙化表面改性，获得富含巯基的NO驱动基体；NO驱动基体与巯丙基三乙氧基硅烷中的硅羟基脱水结合，获得富含巯基的NO驱动基体；
(2)将步骤(1)中得到的富含巯基的NO驱动基体与水溶性交联剂中的马来酰亚胺基团在一定的温度下进行加成反应一段时间，离心洗涤后得到表面富含羟基琥珀酰亚胺基团的NO驱动基体；
(3)将步骤(2)中得到的表面富含羟基琥珀酰亚胺基团的NO驱动基体与外泌体在低温条件下混合，分离纯化得到工程化外泌体纳米马达。
其中，当一氧化氮驱动基体为共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物时，步骤(1)中进行巯丙化表面改性一氧化氮驱动基体的浓度为105-1012个/mL，3-巯丙基三乙氧基硅烷用量为0.1-10mL，反应温度为10-50℃，反应时间为10-48h；当一氧化氮驱动基体为负载L-精氨酸的碗状介孔硅纳米材料时，步骤(1)中进行巯丙化表面改性碗状介孔硅纳米材料的质量为1-50mg，3-巯丙基三乙氧基硅烷用量为0.01-1mL，氨丙基三乙氧基硅烷用量为0.01-1mL，反应温度为10-50℃，反应时间为10-48h。
其中，步骤(2)中富含巯基的NO驱动基体的浓度为105-1012个/mL，水溶性交联剂浓度约为0.1-10mg/mL，反应温度为10-50℃，反应时间为10-48h。
其中，步骤(3)中表面富含羟基琥珀酰亚胺基团的NO驱动基体与外泌体个数比为10/1-1/10，反应温度为0-10℃，反应时间为1-10h。
作为优选，步骤(1)所述NO驱动基体为富含羧基的共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物，其制备过程为：将甲基丙烯酸酐与L-精氨酸在去离子水、1,4-二氧六环与三乙胺的混合溶剂中反应分离纯化后得到精氨酸单体；将得到的精氨酸单体溶解于去离子水中，加入引发剂与双键交联剂，超声分散反应后分离纯化，得到共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物。
进一步地，所述精氨酸单体与交联剂的摩尔比为1-20，水溶性引发剂偶氮二异丁脒盐酸盐与含有二硫键的双键交联剂的摩尔比为0.1-1，反应时间为0.5-5h，反应温度为50-350℃。
作为另一种优选，步骤(1)所述NO驱动基体为富含羧基的负载L-精氨酸的碗状介孔硅纳米材料，其制备过程为：以CTAB为模板剂，浓氨水为催化剂，乙醇为助溶剂的混合体系中，加入双(γ-三乙氧基硅基丙基)四硫化物和正硅酸乙酯的混合前驱体进行脱水缩合，并在氢氧化钠的刻蚀作用下形成碗状介孔硅纳米材料；将得到的碗状介孔硅纳米材料利用介孔限域效应，在高浓度的精氨酸溶液进行物理吸附，形成负载L-精氨酸的碗状介孔硅纳米材料。
进一步地，所述CTAB质量约为0.1-0.5g，双(γ-三乙氧基硅基丙基)四硫化物与正硅酸乙酯的体积比为0.1-1，反应时间为12h-36h，反应温度为25-50℃；所述氢氧化钠的浓度为0.1-1M，刻蚀时间为10-60min，反应温度约为25-50℃；所述高浓度的精氨酸溶液浓度为0.1-10mg mL-1。
本发明所述的工程化外泌体纳米马达在生物医药领域中的应用。
本发明所述的工程化外泌体纳米马达在制备治疗癌症、心脑血管疾病药物中的应用。
本发明首次将通过特定的方法将外泌体和NO驱动基体的结合。外泌体携带诸多活性物质，包含DNA，RNA，蛋白质，脂质和小分子代谢物等，因此在对其工程化时需要对反应溶剂、温度、pH进行特殊考虑，既要实现外泌体的工程化修饰，又要保证外泌体在工程化过程的活性保持，而单纯混合方法无法获得工程化的外泌体，其结合存在困难，本发明是通过将NO驱动基体先进行表面巯基化，再利用水溶性交联剂中的马来酰亚胺基团与巯基化的NO驱动基体结合，后再利用水溶性交联剂中羟基琥珀酰亚胺基团与外泌体表面的氨基结合，工程化过程条件温和，能够保证反应的发生和保持外泌体的生物活性。
本发明的纳米马达与单纯NO驱动基体相比，不仅具有NO驱动基体相似的运动能力和NO的生理功能，还具有外泌体所具备的靶向炎症部位的能力，同时具有外泌体所具备的修复损伤的能力。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明工程化外泌体纳米马达由表面巯基化的两性离子聚合物或碗状介孔硅纳米材料以自组装或负载的方法结合精氨酸为一氧化氮(NO)驱动基体，并将其用于工程化修饰外泌体。同时，两性离子基体在细胞环境的还原型谷胱甘肽作用下降解，可通过肝脏和肾脏的代谢作用被清除人体。
2、本发明制备方法简单高效，合成条件温和，材料分散性能良好，合成的工程化外泌体纳米马达具有优异的生物相容性，两性离子聚合物具有细胞膜的仿生物化性质，具有优异的抗非特性蛋白吸附/粘附效果，在体内具有低免疫原性。介孔二氧化硅具有较大的比表面积和孔道限域效应，能够提高货物装载量和实现其可控长期释放。同时，L-精氨酸是体内常见氨基酸分子。其次，纳米马达的反应产物各有其用，无废料，催化产物之一的一氧化氮气体分子是机体内信号分子，可用于炎症或癌症治疗；另外，良好生物相容性的外泌体，具备体内循环时间长、靶向病灶部位、修复受损部位等优点，从而可作为良好的药物递送载体。
3、本发明制备的方法首次将外泌体和NO驱动基体的结合得到的工程化外泌体纳米马达，其可以首先利用外泌体精准靶向到病灶部位、其次利用NO驱动基体在炎症及活性氧微环境具有主动运动能力能够靶向到特定的炎症细胞，从而实现工程化外泌体纳米马达的逐级靶向效果和提高治疗效果，保证单纯的外泌体在作为药物载体实现在病患深处的药物递送。
附图说明
图1为实施例1得到的间充质干细胞外泌体的透射电镜图；
图2为实施例2得到的共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物的透射电镜图；
图3为实施例2得到的工程化外泌体纳米马达的透射电镜图；
图4为实施例2得到的工程化外泌体纳米马达构建过程中不同材料的表面电位；
图5为实施例4得到的碗状介孔二氧化硅纳米材料的透射电镜图；
图6为实施例4得到的碗状介孔二氧化硅纳米材料的孔径分布图；
图7为工程化外泌体纳米马达的荧光图；
图8为工程化外泌体纳米马达运动的MSD拟合曲线；
图9为实施例2中在5×105cell/mL炎症刺激类神经细胞下干细胞外泌体(a)、共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物(b)和工程化外泌体纳米马达(c)的运动速度；
图10为外泌体和工程化外泌体纳米马达的细胞摄取效率。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明中细胞均市售可得。如人脐带间充质干细胞、类神经细胞SH-SY5Y、内皮细胞HUVECs为市售均可，本发明的人脐带间充质干细胞也可以替换成皮肤干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞等其他干细胞。
实施例1
外泌体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将105个/mL人脐带间充质干细胞接种于T75培养瓶，增加完全培养液至10mL/瓶，放置于CO2培养箱37℃培养48h；待细胞在培养瓶中生长密度约为70％，弃去上层培养液，替换10mL/瓶无外泌体血清培养液(含有20ng/mL血管内皮细胞粘附分子1(VCAM-1))；37℃培养48h后，收集上层细胞培养液，并保存于-80℃；
(2)采用差速离心法获得外泌体，将细胞培养液在4℃下2000rpm离心20min，收集上层的细胞培养液，弃去下层的死细胞；接着将上层培养液在4℃下10000rpm离心30min，收集上层的细胞培养液，弃去下层的细胞碎片；随后将上层培养液在4℃下100000rpm离心120min，弃去上层细胞培养液，收集下层外泌体，分散于PBS(pH＝7.5)中并保存于-80℃，浓度109个/mL。如图1所示，获得的人脐带间充质干细胞外泌体的粒径约90nm，呈现为分散且规则球形纳米粒子(EXO)。
实施例2
一种共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物工程化外泌体纳米马达的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取2g L-精氨酸溶于20mL去离子水和8.5mL 1,4-二氧六环的混合溶剂中，加入4.5mL三乙胺。然后用冰水浴冷却混合溶液，搅拌并逐滴加入3mL甲基丙烯酸酐，滴加约10min。移除冰水浴，在室温下搅拌反应过夜。产物用400mL丙酮沉淀，并向产物慢慢滴入丙酮，待溶液分层后，使用吸管轻轻吸出下层的白色乳液，8000rpm离心10min，得到的沉淀溶解在少量去离子水中，再次在丙酮中沉淀，得到白色沉淀，在室温下真空干燥，得到精氨酸单体；
(2)称取0.0624mmol N,N'-双(丙稀酰)胱胺(交联剂)加入10.75mL去离子水，超声10min溶解，加入到反应烧瓶中通冷凝水，在N2氛围下纯化30min。称取0.0184mmol偶氮二异丁脒盐酸盐(引发剂)，加入0.5mL去离子水溶解，并且用注射器注入上述的反应烧瓶中，再向烧瓶中加入精氨酸单体溶液(步骤(1)得到的0.252mmol精氨酸单体分散于11mL去离子水)，在N2保护下140℃反应1h。产物离心(10000rpm，10min)，沉淀并用水洗涤3次，得到共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物。如图2所示，合成的共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物呈现为分散且规则球形纳米粒子(PMA)；
(3)取步骤(2)中得到的共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物和1mL3-巯丙基三乙氧基硅烷室温下共混24h得到109个/mL的巯基化NO驱动基体，离心弃去上清，固体产物分散于0.5mL PBS(pH＝7.5)缓冲液(PMA-SH，2×109个/mL)，加入0.5mg水溶性交联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐25℃下混合12h，产物离心(10000rpm，10min)，沉淀用水洗涤3次，得到表面富含羟基琥珀酰亚胺基团的共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物(PMA-SMCC，109个)。
(4)将步骤(3)产物超声分散于0.5mL PBS(pH＝7.5)后，加入实施例1中得到的人脐带间充质干细胞外泌体(0.5mL，109个/mL)后在4℃下共混24h，产物离心(10000rpm，10min)，取沉淀并用PBS洗涤3次，得到工程化外泌体纳米马达(PMA/EXO)，分散于1mL PBS中浓度为109个/mL。如图3所示，制备的工程化外泌体纳米马达，呈现为分散的花生状纳米粒子。
实施例3
工程化外泌体纳米马达的表面电位检测：
将实施例1中的人脐带间充质干细胞外泌体(EXO)、实施例2中得到的逐步表面改性的NO纳米马达(PMA-SH)和(PMA-SMCC)和工程化外泌体纳米马达使用PBS配置为107个/mL的溶液(NanoSight纳米颗粒跟踪分析仪)，将上述不同材料的溶液加入电位池中，使用纳米电位分析仪测定不同材料的表面电位。如图4所示，实施例1中的人脐带间充质干细胞外泌体(EXO)的电位为负值，这是因为细胞膜具有电负性。此外，实施例2中得到的两性离子聚合物(PMA)表面富含大量的羧基，因此PMA的表面电位为负值。随后，逐步对PMA修饰负电的巯基(PMA-SH)和马来酰亚胺基团(PMA-SMCC)，材料表面电位逐渐降低。最后，由于EXO的电负性，实施例2中得到工程化外泌体纳米马达(PMA/EXO)的电负性进一步降低。工程化外泌体纳米马达是由两性离子基NO纳米马达逐步修饰马来酰亚胺交联剂，再与外泌体结合。由于各物质表面特有的官能团所带的电负性不同。因此本实施例中的电位检测证明工程化外泌体纳米马达制备过程的每步均合成成功。
实施例4
一种负载L-精氨酸的碗状介孔硅纳米材料工程化外泌体纳米马达的制备方法，包括以下步骤：
(1)0.16g CTAB溶于75mL H2O与30mL乙醇，超声分散后，再加入1mL(质量分数25％)的氨水；在35℃下，加入混合前驱体溶液(0.1mL TESPTS与0.25mL TEOS)反应24h。产物离心收集，沉淀用乙醇与水各清洗3次；再次分散于63mL NaOH(0.48M)，室温下刻蚀30min，产物离心收集，沉淀用水清洗3次，使用索式提取装置去除模板剂CTAB，得到碗状介孔硅纳米材料。如图5所示，制备的介孔硅纳米材料，呈现为开口向上的碗状纳米粒子。此外，图6的孔径分布数据显示制备的碗状介孔硅纳米材料的孔径大约在4nm。
(2)将称取20mg步骤(1)得到的介孔硅纳米材料溶解于20mL H2O的混合液中，加入50μL氨丙基三乙氧基硅烷与50μL3-巯丙基三乙氧基硅烷25℃混合24h。产物离心(10000rpm，10min)，沉淀并用水洗涤3次，再次分散于5mL去离子水，与200mg L-Arg室温混合24h，产物离心，弃去上清，沉淀用水洗涤3次，得到负载L-精氨酸的碗状介孔硅纳米材料即为表面巯基化的NO驱动基体；
(3)将步骤(2)中的负载L-精氨酸的碗状介孔硅纳米材料分散于0.5mL PBS(pH＝7.5)缓冲液(浓度为0.5×109个/mL)，加入0.5mg 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐室温下混合12h，产物离心(10000rpm，10min)，沉淀用水洗涤3次，得到表面富含羟基琥珀酰亚胺基团的负载L-精氨酸的碗状介孔硅纳米材料(109个)。
(4)将步骤(3)产物超声分散于0.5mL PBS(pH＝7.5)后，加入实施例1中得到的人脐带间充质干细胞外泌体(0.5mL，109个/mL)后在4℃下共混24h，产物离心(10000rpm，10min)，取沉淀并用PBS洗涤3次，得到工程化外泌体纳米马达，分散于1mL PBS(pH＝7.5)中浓度109个/mL。本实施例制备的纳米马达呈现为介孔硅纳米材料与球形外泌体结合成的花生状纳米粒子。
实施例5
工程化外泌体纳米马达的荧光标记表征：
(1)将实施例1中得到的0.5mL人脐带间充质干细胞外泌体(109个/mL)与0.5mL细胞膜染料DiO(20μM)，室温下避光染色10min，在4℃下离心(100000rpm，120min)，得到DiO荧光标记的人脐带间充质干细胞外泌体。
(2)将实施例2的步骤(2)最后产物0.5mg共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物以及实施例4的步骤(3)最后产物0.5mg负载L-精氨酸的介孔硅纳米材料分别和1mL 3-巯丙基三乙氧基硅烷室温下共混24h后，弃去上清，产物离心并分散于0.5mL PBS(pH＝7.5)缓冲液，加入0.5mg 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐和10μLCy5-马来酰亚胺(1mg/mL)室温下混合12h，产物离心(10000rpm，10min)，沉淀并用水洗涤3次，得到Cy5荧光标记的共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物纳米粒子和Cy5荧光标记的负载L-精氨酸的介孔硅纳米材料；
(3)将步骤(1)得到的DiO荧光标记的外泌体与步骤(2)得到的Cy5荧光标记的共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物或负载L-精氨酸的介孔硅纳米马达按个数比1：1在4℃下共混24h，产物离心(10000rpm，10min)，沉淀用PBS洗涤3次，得到两种荧光标记的工程化外泌体纳米马达。
(4)将步骤(3)得到的两种荧光标记的工程化外泌体纳米马达分散于PBS缓冲液(浓度为109个/mL)，滴加到含有PBS溶液的14mm细胞培养皿，体积为1mL，即刻使用荧光显微镜观察荧光标记的工程化外泌体纳米马达的结合情况。如图7所示，荧光标记的共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物工程化外泌体纳米马达中红色荧光标记的纳米粒子与绿色荧光标记的外泌体较好地重叠在一起，说明工程化外泌体纳米马达制备成功；同样荧光标记的负载L-精氨酸的碗状介孔硅纳米材料工程化外泌体纳米马达中红色荧光标记的纳米粒子与绿色荧光标记的外泌体也呈现出重叠在一起的结果。
实施例6
工程化外泌体纳米马达在5×105cell/mL密度的炎症刺激神经细胞(或内皮细胞)环境中的运动性能研究：
(1)将类神经细胞SH-SY5Y或(内皮细胞HUVECs)以5×105cell/mL接种于14mm细胞培养皿中，完全培养基体积为1mL，置于37℃恒温培养箱内，待24h后细胞贴壁；加入炎症刺激因子(0.1mM脂多糖)，刺激24h；
(2)取10μL实施例1中的间脐带间充质干细胞外泌体(109个/mL，PBS配制)、实施例2的步骤(2)最后产物共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物(109个/mL，PBS配制)、实施例4的步骤(3)最后产物负载L-精氨酸的介孔硅纳米材料(109个/mL，PBS配制)、实施例2和4制备的工程化外泌体纳米马达(109个/mL，PBS配制)，分别直接加入上述含有1mL培养液贴壁细胞培养皿中，即刻使用荧光显微镜观察并记录纳米马达在细胞环境中的运动情况。
(3)根据实施例1中的脐带间充质干细胞外泌体、实施例2中共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物、实施例2的工程化外泌体纳米马达在细胞环境中的运动行为分析。如图8所示，工程化外泌体纳米马达在细胞环境下的运动轨迹符合二次函数，说明其运动行为属于自主运动。此外，计算出外泌体、共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物和工程化外泌体纳米马达的运动速度分别为1.34、4.35、2.63μm/s(图9)。结果显示与单纯外泌体的运动速度相比，具有自主运动能力的两性离子基纳米马达运动速度显著提高。工程化外泌体纳米马达的运动速度有所减少，可能是因为材料自身重力增加，也明显比单纯外泌体要快。
同样实施例1中的脐带间充质干细胞外泌体和实施例4中负载L-精氨酸的介孔硅纳米材料和工程化外泌体纳米马达在细胞环境中的运动轨迹结果显示与负载L-精氨酸的介孔硅纳米材料的运动速度相比，工程化外泌体纳米马达的运动速度有所减少，其可能原因是负载外泌体后材料自身重力增加，导致其运动速度减慢，但也明显比单纯外泌体要快。
以上数据说明工程化外泌体纳米马达运动轨迹即是在炎症刺激的细胞内(微环境含有较高浓度的活性氧)，其具有较好的自主运动能力。
实施例7
工程化外泌体纳米马达在炎症细胞模型中的靶向性能研究：
(1)将200μL SH-SY5Y细胞(细胞密度为1×105个/mL)接种于6孔板内，37℃培养过夜；随后加入H2O2，使其终浓度为0.1mM，继续培养24h；随后向孔板内分别加入10μL实施例5中的DiO荧光标记的外泌体(109个/mL)、Cy5荧光标记的共价键合L-精氨酸的两性离子聚合物(109个/mL)和荧光标记的工程化纳米马达(109个/mL)，培养24h；
(2)将上述孔板内上清液全部收集到离心管内，使用0.1mL PBS清洗三次，并洗涤液收集到上述的离心管内，使用PBS定容到1mL记为培养上清液；再加入0.1mL胰酶在37℃消化10min；再向孔板内加入0.5mL PBS，将细胞悬液转移到新的离心管内进行离心收集细胞(1000rpm，5min)；离心结束后，弃上清加入0.1mL细胞裂解液，使用PBS定容到1mL记为细胞液。
(3)使用荧光分光光度计分别检测培养上清液和细胞液的荧光强度，使用公式细胞摄取效率(％)＝细胞液的荧光强度/(细胞液的荧光强度+培养上清液的荧光强度)×100％来计算不同样品的细胞摄取效率。如图10所示，与单纯外泌体EXO的细胞摄取效率相比，PMA/EXO的细胞摄取效率显著提高，这说明基于自主运动的纳米马达利用细胞炎症微环境，较好实现靶向与聚集，保证单纯的外泌体在作为药物载体实现在病患深处的药物递送。
实施例8
实施例8与实施例2制备方法相同，不同之处在于：精氨酸单体与交联剂的摩尔比为1，引发剂与交联剂的摩尔比为0.1，反应时间约为0.5h，反应温度为350℃；进行巯丙化表面改性一氧化氮驱动基体的浓度为105个/mL，3-巯丙基三乙氧基硅烷用量为0.1mL，反应温度为10℃，反应时间为48h；富含巯基的NO驱动基体的浓度为105个/mL，水溶性交联剂浓度为0.1mg/mL，反应温度为10℃，反应时间为48h；表面富含羟基琥珀酰亚胺基团的一氧化氮驱动基体与外泌体个数比为10/1，反应温度为0℃，反应时间为24h。
实施例9
实施例9与实施例2制备方法相同，不同之处在于：所述精氨酸单体与交联剂的摩尔比为20，引发剂与交联剂的摩尔比为1，反应时间约为5h，反应温度为50℃；进行巯丙化表面改性一氧化氮驱动基体的浓度为1012个/mL，3-巯丙基三乙氧基硅烷用量为10mL，反应温度为50℃，反应时间为10h；富含巯基的NO驱动基体的浓度为1012个/mL，水溶性交联剂浓度为10mg/mL，反应温度为50℃，反应时间为10h；表面富含羟基琥珀酰亚胺基团的一氧化氮驱动基体与外泌体个数比为1/10，反应温度为10℃，反应时间为1h。
实施例10
实施例10与实施例4制备方法相同，不同之处在于：CTAB质量为0.1g，双(γ-三乙氧基硅基丙基)四硫化物与正硅酸乙酯的体积比为1：1，反应时间为12h，反应温度为50℃；氢氧化钠的浓度为0.1M，刻蚀时间为60min，反应温度约为50℃；高浓度的精氨酸溶液浓度为0.1mg mL-1；进行巯丙化表面改性碗状介孔硅纳米材料的质量为1mg，3-巯丙基三乙氧基硅烷用量为0.01mL，氨丙基三乙氧基硅烷用量为0.01mL，反应温度为10℃，反应时间为48h。
实施例11
实施例11与实施例4制备方法相同，不同之处在于：CTAB质量为0.5g，双(γ-三乙氧基硅基丙基)四硫化物与正硅酸乙酯的体积比为1：10，反应时间为36h，反应温度为25℃；氢氧化钠的浓度为1M，刻蚀时间为10min，反应温度约为25℃；高浓度的精氨酸溶液浓度为10mg mL-1；进行巯丙化表面改性碗状介孔硅纳米材料的质量为50mg，3-巯丙基三乙氧基硅烷用量为1mL，氨丙基三乙氧基硅烷用量为1mL，反应温度为50℃，反应时间为10h。
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