一种稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系及抗体胶体金检测试纸条的制备方法
技术领域
本发明涉及生物检测
技术领域
，特别涉及一种稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系及抗体胶体金检测试纸条的制备方法。背景技术
牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)，亦称为牛病毒性腹泻/黏膜病毒，是黄病毒科瘟病毒属重要成员，与猪瘟病毒、羊的边界病毒同科同属，在血清学检测时存在交叉反应。BVDV是在世界范围内广泛流行严重危害养殖业的重要病原，病毒可感染牛、羊、猪等多种动物。BVDV的感染造成养殖业巨大的经济损失，在美国，每100万犊牛中，由BVDV感染造成的损失可达2000至5700万美元不等。在我国，李佑民等于1983年首次分离并鉴定出BVDV。自此以来，我国新疆、内蒙、吉林、黑龙江、河南、山东、辽宁等20多个省、市、自治区均检出此病，个别地区阳性率在85％以上。由于没有很好的免疫防护措施，本病呈上升趋势，对牛群的肥育、产奶和繁殖影响极大，给养牛业造成了严重危害。BVDV的感染可引发多种临床疾病，包括呼吸系统疾病、生殖系统疾病、以及免疫抑制。还可以为其他致病原侵染动物创造条件引起继发感染，这样对牛群的危害也是不容忽视的。
BVDV依据接种细胞是否产生致细胞病变(cytopathogenic effects,CPE),将BVDV分为两种生物型，致细胞病变型(cytopathic,cp)与非致细胞病变型(non-cytopathic,ncp)。临床上分离毒株多为非致细胞病变型。ncpBVDV经常随污染牛血清而感染细胞，造成细胞的持续性牛病毒性腹泻病毒感染。
牛血清是生物制品研发及医学研究的重要原材料，牛血清中含有牛病毒性腹泻病毒抗体会影响同科属其他病毒疫苗生产，如猪瘟病毒。含有牛病毒性腹泻病毒抗体的血清严重降低猪瘟疫苗的效价。因此采集血清时需要逐头牛进行检查。目前，常规的血清中和实验方法检测步骤繁琐、耗时，需要专业人员进行操作且主要依赖实验室。用于该病毒抗体检测的商品化试剂盒主要是进口的试剂盒，价格昂贵而且需要专业人员操作和精明仪器(酶标仪)不能满足基层实际需求，严重阻碍了牛病毒性腹泻病检测的普及和推广。因此，研究一种简单、快捷的牛病毒性腹泻病毒抗体检测方法具有十分重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系及抗体胶体金检测试纸条的制备方法。应用该细胞系不需要再接种毒种，按照正常细胞传代，既可节约毒种用量，又避免操作复杂易造成污染等问题，节省人力物力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种持续稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系，该细胞系按照以下方法制备：将牛病毒性腹泻病毒接种于敏感细胞系，通过有限稀释法筛选持续性感染细胞，进行克隆纯化和病毒滴度测定，确定滴度高于107.0TCID50的细胞建系，得到持续稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系；
敏感细胞系为MDBK细胞系、BT细胞系、PT细胞系、ST细胞系、PK细胞系、CRFK细胞系、F81细胞系、MDCK细胞系中的一种。
作为优选，克隆纯化的次数为3次或3次以上。
在本发明提供的具体实施例中，克隆纯化的次数为3次。
作为优选，每次克隆纯化后均通过免疫荧光方法确定病毒持续存在。
作为优选，牛病毒性腹泻病毒为ncp型牛病毒性腹泻病毒，且病毒滴度高于107.0TCID50。
作为优选，持续性感染牛病毒性腹泻病毒的细胞系的保藏编号为CGMCCNo.22351。
本发明还提供了一种牛病毒性腹泻病毒抗体胶体金检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：
A)将上述细胞系进行扩大培养，收获细胞培养上清液和细胞，反复冻融2～3次后，通过差速离心和PEG沉淀，获得纯化的牛病毒性腹泻病毒抗原；
B)将牛病毒性腹泻病毒抗原与胶体金进行第一偶联，得到牛病毒性腹泻病毒抗原-胶体金偶联标记物；
将IgG与胶体金进行第二偶联，得到IgG-胶体金偶联标记物；
C)将牛病毒性腹泻病毒抗原-胶体金偶联标记物、IgG-胶体金偶联标记物分别喷在玻璃纤维素膜上，干燥，获得金标结合垫；
将牛病毒性腹泻病毒抗原、IgG分别划膜于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上；
D)将样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘贴在底板上，切条、组装、密封，获得牛病毒性腹泻病毒抗体胶体金检测试纸条。
本发明所制备的胶体金检测试纸条可应用于牛病毒性腹泻病毒免疫效果监测，还可以应用于生物制品厂中牛血清中牛病毒性腹泻病毒抗体检测。
作为优选，胶体金的粒径大小为40～60nm。
作为优选，第一偶联时，牛病毒性腹泻病毒抗原与胶体金溶液的用量比例为30～40μg:1mL。
作为优选，第二偶联时，IgG与胶体金溶液的用量比例为3.5～4.5μg:1mL。
作为优选，步骤B)中IgG为小鼠IgG，步骤C)中IgG为羊抗鼠IgG。
在本发明提供的具体实施例中，底板为PVC底板。
本发明提供了一种稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系及抗体胶体金检测试纸条的制备方法。该细胞系按照以下方法制备：将牛病毒性腹泻病毒接种于敏感细胞系，通过有限稀释法筛选持续性感染细胞，进行克隆纯化和病毒滴度测定，确定滴度高于107.0TCID50的细胞建系，得到持续性感染牛病毒性腹泻病毒的细胞系；敏感细胞系为MDBK细胞系、BT细胞系、PT细胞系、ST细胞系、PK细胞系、CRFK细胞系、F81细胞系、MDCK细胞系中的一种。本发明的有益效果是：
本发明发现牛病毒性腹泻病毒可以持续性感染敏感细胞，并依据该现象制备了可以持续性表达牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系，应用该细胞系不需要再接种毒种，按照正常细胞传代，既可节约毒种用量，又避免操作复杂易造成污染等问题，节省人力物力。本发明的牛病毒性腹泻病毒抗体胶体金检测试纸条具有特异性强、灵敏度高、操作简单快捷等特点，易于推广，适用于基层养殖场检测，具有广阔的市场前景。
本发明将酶联免疫原理与胶体金层析技术结合，制备检测牛病毒性腹泻病毒抗体的胶体金检测试纸条并拟应用于临床，提高牛病毒性腹泻病的预防能力，具有操作简单快速、检测结果清楚易于判断、特异性强、敏感性高、无需仪器设备等优点，因此，非常适用于现场、门诊等实验条件有限的场所进行临床样品检测。本发明提供了上述试纸条的制备方法，适用于工业生产。
生物保藏说明
分类命名：MDBK-BV(稳定产生牛病毒性腹泻病毒的牛肾细胞系)，于2021年06月03日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.22351。
附图说明
图1为持续稳定产生牛病毒性腹泻病毒细胞系的荧光检测结果；
图2为本发明的牛病毒性腹泻病毒抗体胶体金检测试纸条灵敏度检测结果。
具体实施方式
本发明公开了一种稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系及抗体胶体金检测试纸条的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明公开了一种用于能够稳定表达牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系及以此为基础制备牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测试纸条。具体方案如下：
1、持续稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原细胞系的制备：将ncp型牛病毒性腹泻病毒接种于敏感细胞系，通过有限稀释法筛选持续性感染细胞并进行3次克隆纯化，每次克隆纯化均通过免疫荧光确定病毒持续存在。经克隆纯化后扩大培养，通过免疫荧光和病毒滴定实验确定持续稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原细胞系；
所述敏感细胞系是指可以允许牛病毒性腹泻病毒复制的细胞，包括MDBK细胞系，BT细胞系，PT细胞系，ST细胞系，PK细胞系，CRFK细胞系，F81细胞系，MDCK细胞系。
2、采用差速离心和PEG沉淀纯化病毒：将获得的能够持续感染牛病毒性腹泻病毒的敏感细胞系按照正常细胞传代，扩大培养，收获细胞培养上清液和细胞，反复冻融3次后，通过差速离心和PEG沉淀获得纯化的牛病毒性腹泻病毒抗原；
3、牛病毒性腹泻病毒抗原与胶体金的偶联标记物的制备：取常温放置的40-60nm的胶体金与纯化的牛病毒性腹泻病毒抗原混匀，抗原与胶体金溶液的用量比例为30μg～40μg:1mL，按照此用量比例逐滴加入纯化的牛病毒性腹泻病毒抗原，再加入终浓度为1％的牛血清白蛋白，搅拌后获得牛病毒性腹泻病毒抗原与胶体金的偶联标记物，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化；
4、小鼠IgG与胶体金的偶联标记物的制备：按照小鼠IgG与胶体金溶液的用量比例为3.5μg～4.5μg:1mL制备小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，再加入终浓度为1％的牛血清白蛋白，搅拌后获得小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化；
5、试纸条的组装：采用喷金仪将牛病毒性腹泻病毒抗原与胶体金的偶联标记物、小鼠IgG与胶体金的偶联标记物分别喷在玻璃纤维素膜上，室温条件下自然干燥，密封，获得金标结合垫；采用划膜仪将纯化的牛病毒性腹泻病毒抗原、羊抗鼠IgG分别划膜于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上；将处理好的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜依次粘帖在PVC底板上，切条、组装、密封，获得牛病毒性腹泻病毒抗体胶体金检测试纸条，室温保存。
本发明的牛病毒性腹泻病毒抗体胶体金检测试纸条，包括PVC底板、样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸收垫，将上述材料依次粘帖在PVC底板上，金标结合垫包被有纯化的牛病毒性腹泻病毒抗原与胶体金的偶联标记物以及小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，硝酸纤维素膜上的检测线包被有纯化的牛病毒性腹泻病毒抗原，硝酸纤维素膜上的质控线包被有羊抗鼠IgG。
本发明用于能够持续稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系及以此为基础制备牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测试纸条。其主要利用非致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒毒株能够持续性感染牛源细胞，将非致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒接种敏感细胞，通过克隆纯化和免疫荧光技术测定病毒滴度确定高于107.0TCID50/mL的细胞系为稳定感染牛病毒性腹泻病毒的细胞系。依此细胞系制备的病毒作为抗原，纯化后用于BVDV抗体胶体金快速检测试纸条。该试纸条具有操作方便快捷，不需要特殊仪器设备，可用于血清中牛病毒性腹泻病毒抗体检测。
本发明的牛病毒性腹泻病毒抗体胶体金检测试纸条的使用方法如下：
1、采集牛血清，待血清自然析出后用移液器取5μL样品用于检测。
2、将吸取的5μL样品加入试纸条的样品孔前端，随之滴加两滴稀释液于样品孔中，3～10分钟即可显示结果，10分钟时读取结果。
结果判断：
1、阳性：在检测线和质控线处各出现一条红色条带，判定为阳性；检测线5条带色泽的深浅依检测样品中牛病毒性腹泻病毒抗体效价的高低而变化，效价越高色带越深，反之越浅。
2、阴性：在质控线出现一条红色条带，检测线未出现红色条带，说明检测样品中无牛病毒性腹泻病毒抗体存在。
3、无效：仅在检测线有条带或在检测线和质控线均无明显条带出现，视为试纸条检测无效。
本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1持续性稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原细胞系的制备
1)病毒接种：将无外源病毒污染的对牛病毒性腹泻病毒敏感的传代细胞系MDBK细胞系接种于6孔细胞培养板中，当细胞融合率达70％后，弃去原培养液，以MOI值为0.1～0.5接种无细胞病变型牛病毒性腹泻病毒，感作1h后加入含2％血清的细胞培养液，至37℃，5％CO2培养2-3日。
2)持续性感染细胞克隆：将上述培养在6孔板内的接毒细胞弃去培养液，用PBS清洗1-2次，经胰酶消化分散，并用含8％血清的DMEM培养液稀释传代至96孔细胞培养板，显微镜下观察，选择并标记孔中只有一个细胞的孔。
3)荧光鉴定：待2)中细胞数量增加后，消化所标记孔内细胞分为两部分，一部分加入96孔板中用于免疫荧光检测，剩余部分扩大培养至48孔板。96孔板中细胞待细胞贴壁后，弃去培养液用预冷的固定液(甲醇：丙酮＝1：3)固定20min，弃固定液，用PBS清洗一次后，加入FITC标记的抗BVDV抗体，37℃孵育30min，弃去荧光抗体，PBS清洗三次后置于荧光显微镜下观察。所有细胞均显示特异性的黄绿色荧光。
4)克隆的持续性感染细胞扩大培养：将扩大培养至48孔板细胞继续培养传代，每次传代同时应用免疫荧光方法检测克隆细胞中是否存在持续性病毒感染。
5)克隆细胞中牛病毒性腹泻病毒毒价滴定：将培养扩大的病毒感染的克隆细胞株收获，反复冻融3次后，进行病毒滴定并通过免疫荧光测定病毒含量(TCID50)，见图1。最后确定病毒含量高于107.0TCID50/mL的细胞为持续性稳定产生BVDV的细胞系。
实施例2病毒的纯化
将应用持续稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系扩大培养，收获病毒抗原采用超声波或冻融方法使细胞破碎释放出病毒，调整溶液pH值至7.2-7.5，加入PEG6000至终浓度为8％(w/v)，4℃过夜，10000g离心2h，将沉淀溶于PBS中即为浓缩纯化病毒抗原。
实施例3胶体金溶液的制备
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液：取1％氯金酸溶液1mL，加入99mL的超纯水配制成终浓度为0.01％的氯金酸溶液，加热至沸腾后，加入1％柠檬酸三钠1mL并继续加热，溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为酒红色，颜色稳定后继续加热5分钟，室温冷却后4℃保存备用，获得胶体金溶液。通过分光光度计测定胶体金溶液吸光度应在524-536nm，透射电镜观察胶体金颗粒大小基本一致，分布均匀，直径在40-60nm之间方为合格。
实施例4牛病毒性腹泻病毒抗原与胶体金的偶联标记物(金标牛病毒性腹泻病毒抗原)的制备
取常温放置的40-60nm的胶体金溶液，加入0.1M的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH值为8.2，在磁力搅拌下，按照纯化的牛病毒性腹泻病毒抗原与胶体金溶液的用量比例(30～40μg:1mL)向胶体金溶液中逐滴加入纯化的牛病毒性腹泻病毒抗原，继续搅拌20分钟，加入终浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)，再搅拌15分钟，获得牛病毒性腹泻病毒抗原与胶体金的偶联标记物即金标牛病毒性腹泻病毒抗原，采用低温超速离心法纯化金标牛病毒性腹泻病毒抗原，以去除溶液中未标记的牛病毒性腹泻病毒抗原和未充分标记的胶体金以及在标记中可能形成的各种聚合物。
实施例5小鼠IgG与胶体金的偶联标记物的制备
用0.1M碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH值为8.2，在磁力搅拌下，按照小鼠IgG与胶体金溶液的用量比例(3.5～4.5μg:1mL)逐滴加入小鼠IgG，继续搅拌20分钟，加入终浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)，再搅拌15分钟，获得小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，通过低温超速离心法纯化小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，以去除溶液中未标记的小鼠IgG和未充分标记的胶体金以及在标记中可能形成的各种聚合物。
实施例6试纸条的组装
(1)采用喷金仪将牛病毒性腹泻病毒抗原与胶体金的偶联标记物、小鼠IgG与胶体金的偶联标记物分别喷在玻璃纤维素膜，牛病毒性腹泻病毒抗原与胶体金的偶联标记物、小鼠IgG与胶体金的偶联标记物的标记量分别为30～40μg:1mL、3.5～4.5μg:1mL，室温条件下自然干燥，密封，获得金标结合垫3，4℃保存备用；
(2)采用划膜仪将牛病毒性腹泻病毒抗原、羊抗鼠IgG分别划膜于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上，牛病毒性腹泻病毒抗原、羊抗鼠IgG的标记量分别2μg/cm、4μg/cm，室温条件下自然干燥，密封，获得带有检测线(包被有纯化的牛病毒性腹泻病毒抗原)和质控线6(包被有羊抗鼠IgG)的硝酸纤维素膜，4℃保存备用；
(3)将上述处理好的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫等材料依次粘贴在PVC底板上，切条、组装、密封，获得本发明的牛病毒性腹泻病毒抗体胶体金检测试纸条，室温保存备用。
实施例7特异性试验
采用本发明的试纸条对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阳性血清、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)阳性血清、牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV3)阳性血清、正常牛血清进行检测。
结果显示：仅牛病毒性腹泻病毒阳性血清出现明显的检测线和对照线，其余血清检测均为阴性，说明本发明的试纸条具有良好的特异性。
实施例8敏感性试验
将牛病毒性腹泻病毒抗体标准品用样本稀释液作2倍倍比稀释，然后分别采用血清中和实验与本发明的试纸条进行检测。
图2结果显示：同一份牛病毒性腹泻病毒阳性血清，血清中和实验检测的最高稀释倍数为64倍，而采用本发明的试纸条进行检测的最高稀释倍数为64倍，说明本发明的试纸条敏感性与血清中和试验一致。
实施例9符合率试验
将本研究室保存的100份临床牛病毒性腹泻病毒血清样品分别用本发明的试纸条和血清中和实验进行平行检测，结果如表1所示，本发明的试纸条相对血清中和实验的符合率为97％。
表1：试纸条和血清中和实验的符合率检测结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
