一种活心丸急性毒性的检测方法
技术领域
本发明属于药物检测方法，具体涉及一种活心丸急性毒性的检测方法。
背景技术
活心丸是由灵芝、人工麝香、熊胆、红花、体外培育牛黄、珍珠、人参、蟾酥、附子、冰片十味药组成，具有益气活血、温经通脉的功效，主治胸痹、心痛，用于冠心病、心绞痛等病症，目前收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第十八册(WS3-B-3452-98)。
冠心病是冠状动脉供血不足引发的临床症候群，主要症状包括心绞痛、急性心肌梗死，二者均是心肌缺血、供氧引起的心肌损害。随着人口结构老龄化，冠心病已经成为死亡原因构成中上升最快的疾病。
与其他同类产品进行对比，活心丸“强心”作用明显，对中医辨证为气虚血瘀、阳虚寒凝及心血瘀阻证的不稳定型心绞痛患者疗效显著。临床数据显示，活心丸缓解混合性心绞痛临床症状、改善心肌缺血方面与长效硝酸甘油片效果相当，总有效率及心电图改善率活心丸更优；在治疗稳定型心绞痛方面，西医基础用药联合活心丸治疗可改善患者心功能，降低收缩压，相对于单纯西药常规治疗更具优势。可见，活心丸在心血管疾病方面有广阔的市场。但是目前活心丸毒理方面的研究报道较少较浅，仍需深入开展研究，为临床合理用药提供理论依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种更加便利的活心丸毒性检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明提供一种活心丸毒性的检测方法，所述方法包括检测心脏和/或肝脏病变情况来确定活心丸的毒性。
在本发明的一些实施方式中，所述检测心脏具体为检测心外膜。
在本发明的一些实施方式中，所述检测心外膜具体为检测心外膜是否出现炎症。
在本发明的一些优选实施方式中，所述炎症为炎性细胞浸润。
在本发明的一些实施方式中，所述检测肝脏具体为检测肝脏中央静脉周围是否出现炎症或肝细胞是否出现空泡化。
在本发明的一些实施方式中，所述炎症为局灶性炎性细胞浸润。
在本发明的一些实施方式中，所述炎症为当组织出现局部性和/或分散性且形态为圆形或卵圆形炎性细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述空泡化为当组织胞质中出现大小不等的圆形空泡，且呈现局灶性和/或大量分散分布。
在本发明的一些实施方式中，所述检测方法为对心脏和/或肝脏组织的病理学检测。
在本发明的一些实施方式中，所述病理学检测的方法为组织病理学检测。
在本发明的一些实施方式中，所述组织病理学检测包含以下步骤：
(1)制作病理切片后进行染色；
(2)显微镜观察组织切片的病理变化。
在本发明的一些实施方式中，所述染色方法为Masson三色染色、HE染色、免疫组化染色、免疫荧光染色或特殊染色。
在本发明的一些优选实施方式中，所述染色方法为HE染色。
在本发明的一些实施方式中，所述活心丸包含以下成分：灵芝、人工麝香、熊胆、红花、体外培育牛黄、珍珠、人参、蟾酥、附子、冰片。
在本发明的一些实施方式中，所述检测具体为检测小鼠的心脏和/或肝脏病变情况。
在本发明的一些实施方式中，所述活心丸的日用量为0～3.5g/kg。
在本发明的一些实施方式中，所述毒性检测为早期毒性检测。
在本发明的一些实施方式中，所述早期具体为给药后1～14天。
在本发明的一些实施方式中，所述小鼠的体重为20±2g。
在本发明的一些实施方式中，所述给药方式为灌胃给药。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种活心丸急性毒性的检测方法，只需要检测心脏的心外膜和肝脏即可。本发明通过大量实验检测到在给药后第2d起，各组小鼠精神状态、活动量、摄食、饮水、毛发等表现均正常。且在同一时间里，与对照组相比，给药组小鼠体质量、16项血常规指标无显著影响、5项血液生化指标谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)的值、给药组的脏器指数无明显变化，其差异均无统计学意义。而且病理组织学显示给药组小鼠心脏心外膜出现轻度炎性细胞浸润、肝脏中央静脉周围出现局灶性炎性细胞浸润且肝细胞少量空泡化，因此后续的关于活心丸的毒性检测可以主要检测心脏心外膜以及肝脏这两部分，也说明活心丸对小鼠的毒性靶器官可能为心脏和肝脏，可以辅助评估临床用药。而且临床用药需注意控制用药剂量，应在合理剂量下服用。
附图说明
图1为活心丸对小鼠体质量的影响。
图2为给药1d活心丸对小鼠血常规指标的影响。
图3为给药14d活心丸对小鼠血常规指标的影响。
图4为给药1d活心丸对小鼠血液生化指标的影响。
图5为给药14d活心丸对小鼠血液生化指标的影响。
图6为给药1d活心丸对小鼠脏器指数的影响。
图7为给药14d活心丸对小鼠脏器指数的影响。
图8为活心丸对小鼠组织病理学的影响(200×)。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
药品：由广州白云山医药集团股份有限公司白云山制药总厂销售的活心丸(批号1190001)。由长春汇力生物技术有限公司销售的谷丙转氨酶试剂盒(批号2019004)、谷草转氨酶试剂盒(批号2019004)、碱性磷酸酶试剂盒(批号2019001)、肌酐试剂盒(批号2019003)、尿素氮试剂盒(批号2019003)。
实验仪器：酶标仪(BioTek公司，型号：Epoch)，全自动生化分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司，型号：Chemray 240)，兽用全自动血液细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号：BC-2800vet)，高速冷冻离心机(SCILOGEX，型号：D3024R)。
实验动物：由北京维通利华实验动物技术有限公司销售的SPF级KM小鼠，雌雄各半，饲养于广州中医药大学华南针灸研究中心动物房屏障环境，室温(23±3)℃，相对湿度40％～70％，室内照明采用昼夜比12h/12h，常规饲料喂养，自由饮水。
采用SPSS 22.0软件进行实验数据统计，数据以平均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，符合方差齐性时，使用LDS法统计，不符合方差齐性时，使用Dunett’s T3法。使用Graphpad Prism 6.0软件制图。
实施例1
1、药物配制：取活心丸于研钵中研磨成粉末状，以生理盐水配制为所需浓度的活心丸药液。12号灌胃针头连接1mL注射针筒抽取药液未见明显堵塞，并可顺畅通过针头，以此药液浓度为最大给药浓度，为0.175g/mL。
2、分组及给药：SPF级KM小鼠80只，适应性饲养3d后，按照性别和体重随机分为空白对照组和给药组，每组40只，雌雄各半。按照活心丸最大给药浓度(0.175g/mL)及给药体积(20mL/kg)，24h内单次经口给药，给药前12h禁食不禁水，给药组给予3.5g/kg活心丸药液，空白对照组给予等体积生理盐水。
3、一般情况观察：各组小鼠灌胃给药后30min内，每10min观察1次；药后30min～2h内，每15min观察1次；药后2h～4h内，每30min观察一次；药后4h～8h内，每1h观察1次；药后12h及药后24h分别观察1次；药后第2d起，每天观察1次。观察指标：小鼠摄食、饮水、活动、精神状态、毛发、排泄物等情况，重点注意小鼠中毒及死亡情况，及时对死亡小鼠解剖观察。
实施例2
密切观察记录实施例1中给药后小鼠一般表现，结果表明：
给药后24h内，与空白对照组相比，给药组小鼠精神状态较差、活动量明显减少、呼吸加快、出现竖毛现象，其中7只小鼠于给药后30min内出现中毒现象，表现为运动失调，活动力明显减弱，呼吸急促，精神萎靡不振，俯卧抽搐，大便呈黑色，1h后中毒小鼠恢复正常。给药后第2d起，各组小鼠精神状态、活动量、摄食、饮水、毛发等表现均正常。
而且给药组小鼠未出现死亡现象，说明小鼠对活心丸的最大耐受剂量为3.5g/kg。根据小鼠最大耐受倍数计算公式：小鼠最大耐受倍数＝[每只小鼠耐受药量(mg)/小鼠平均体重(g)×成人平均体重(kg)/成人日用药量(g)＝(70/20×60/0.12)]，计算得到给药组剂量为成人日用量的1750倍。
实施例3
于给药前、给药后1d、3d、5d、8d、14d记录实施例1中各组小鼠体质量并进行统计分析，结果见图1，由图1可知，各组小鼠体质量随时间增加而增加，且在同一时间里，与对照组相比，给药组小鼠体质量无明显变化，无显著性差异。
实施例4
于给药1d及给药14d后检测实施例1中各组小鼠的血常规指标，各组抽取20只小鼠，雌雄各半，禁食不禁水12h，对小鼠摘除眼球采血，抗凝采血管收集一部分血液，使用全自动血液细胞分析仪进行检测，主要检测指标：中性粒细胞数目、中性粒细胞百分比、红细胞积压、血红蛋白、淋巴细胞数目、淋巴细胞百分比、平均红细胞血红蛋白浓度、平均红细胞血红蛋白含量、平均红细胞体积、单核细胞数目、单核细胞百分比、血小板分布宽度、血小板数目、红细胞数目、红细胞分布宽度变异系数、白细胞数目。
给药1d后对小鼠血常规指标的影响见图2，其中图2中A图为对中性粒细胞数目的影响，图2中B图为对中性粒细胞百分比的影响，图2中C图为对红细胞积压的影响，图2中D图为对血红蛋白的影响，图2中E图为对淋巴细胞数目的影响，图2中F图为对淋巴细胞百分比的影响，图2中G图为对平均红细胞血红蛋白浓度的影响，图2中H图为对平均红细胞血红蛋白含量的影响，图2中I图为对平均红细胞体积的影响，图2中J图为对单核细胞数目的影响，图2中K图为对单核细胞百分比的影响，图2中L图为对血小板分布宽度的影响，图2中M图为对血小板数目的影响，图2中N图为对红细胞数目的影响，图2中O图为对红细胞分布宽度变异系数的影响，图2中P图为对白细胞数目的影响。
给药14d后对小鼠血常规指标的影响见图3，其中图3中A图为对中性粒细胞数目的影响，图3中B图为对中性粒细胞百分比的影响，图3中C图为对红细胞积压的影响，图3中D图为对血红蛋白的影响，图3中E图为对淋巴细胞数目的影响，图3中F图为对淋巴细胞百分比的影响，图3中G图为对平均红细胞血红蛋白浓度的影响，图3中H图为对平均红细胞血红蛋白含量的影响，图3中I图为对平均红细胞体积的影响，图3中J图为对单核细胞数目的影响，图3中K图为对单核细胞百分比的影响，图3中L图为对血小板分布宽度的影响，图3中M图为对血小板数目的影响，图3中N图为对红细胞数目的影响，图3中O图为对红细胞分布宽度变异系数的影响，图3中P图为对白细胞数目的影响。
由图2及图3可知，给药组给药1d及给药14d后活心丸对小鼠16项血常规指标无显著影响，与空白组比较没有显著性差异。
实施例5
测定给药1d及给药14d后活心丸对小鼠血液生化指标的影响，分析活心丸对小鼠血液指标可能的毒性作用。
取实施例4中的另一部分血液，置于不加抗凝剂的离心管中，离心机3000r条件下离心10min后采集上层血清，于-20℃冰箱保存，全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)。
给药1d活心丸对小鼠血液生化指标的影响见图4。其中图4中A图为对碱性磷酸酶的影响，图4中B图为对谷丙转氨酶的影响，图4中C图为对谷草转氨酶的影响，图4中D图为对尿氮素的影响，图4中E图为对肌酐的影响。
给药14d活心丸对小鼠血液生化指标的影响见图5。其中图5中A图为对碱性磷酸酶的影响，图5中B图为对谷丙转氨酶的影响，图5中C图为对谷草转氨酶的影响，图5中D图为对尿氮素的影响，图5中E图为对肌酐的影响。
由图4及图5可知，给药组小鼠5项血液生化指标谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)的值较空白组无显著变化，没有显著性差异。
实施例6
取实施例1中的小鼠解剖观察与病理检查：各组小鼠眼球采血后，脱臼处死并解剖，肉眼观察肠、胃、心、肝、脾、肺、肾、胸腺、睾丸、卵巢等脏器病变情况；取心、肝、脾、肺、肾，除去脂肪、筋膜等组织，用4℃生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分后，称量脏器重量，计算脏器指数，脏器指数＝脏器质量/体质量；称重后用4％多聚甲醛固定制作病理切片，显微镜下观察各脏器病理变化。给药1d及14d后，对所有小鼠解剖，肉眼观察各重要脏器无明显病理变化。对解剖后心、肝、脾、肺、肾五个脏器称重并计算脏器指数。
给药1d活心丸对小鼠脏器指数的影响见图6，其中图6中A图为对心脏指数的影响，图6中B图为对肝脏指数的影响，图6中C图为对脾脏指数的影响，图6中D图为对肺脏指数的影响，图6中E图为对肾脏指数的影响。
给药14d活心丸对小鼠脏器指数的影响见图7，其中图7中A图为对心脏指数的影响，图7中B图为对肝脏指数的影响，图7中C图为对脾脏指数的影响，图7中D图为对肺脏指数的影响，图7中E图为对肾脏指数的影响。
从图6和图7可以看出，与空白对照组比较，给药组的脏器指数无明显变化，其差异无统计学意义。
同样也对给药1d及14d后进行小鼠心、肝、脾、肺、肾五个脏器的病理组织学检查，结果见图8，可以看出，与空白组相比，给药组心脏及肝脏出现明显病变，其中心外膜出现轻度炎性细胞浸润，但未见空泡化、坏死、心肌肥大等病变；给药组肝脏中央静脉周围局灶性炎性细胞浸润，肝细胞出现少量空泡化。给药其余脏器未发现明显病变，与空白组比较无异常。
因此，给药后部分小鼠出现中毒症状，但未发生死亡现象，小鼠对活心丸的最大耐受剂量为3.5g/kg，其剂量为成人每日服用剂量的1750倍，证明活心丸口服毒性较小，按临床规定剂量服用安全有效。
综上所述，本实施例研究了活心丸对小鼠的最大耐受量，检测了给药后小鼠体质量的变化、血常规及血液生化指标的改变、解剖观察小鼠各脏器病变情况、分析脏器指数及进行病理组织学检测，发现活心丸对小鼠体质量、血常规指标、血液生化指标无明显影响，病理组织学显示给药组小鼠心脏心外膜出现轻度炎性细胞浸润、肝脏中央静脉周围出现局灶性炎性细胞浸润且肝细胞少量空泡化，后续的关于活心丸的毒性检测可以主要检测心脏心外膜以及肝脏这两部分。也说明活心丸对小鼠的毒性靶器官可能为心脏和肝脏，临床用药需注意控制用药剂量，应在合理剂量下服用。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
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