单细胞dna损伤的快速检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测
技术领域
，具体涉及一种单细胞DNA损伤的快速检测方法以及试剂盒。背景技术
随着中国经济的加速发展，环境污染也日趋严重。目前，全球范围内的环境污染对人体健康也受到越来越多的关注。其中，环境污染物造成DNA的损伤会影响细胞的遗传稳定性，并可能对后代产生影响，引起孕妇流产、死胎、畸胎和某些遗传性疾病等。由于细胞的DNA损伤会造成疾病，威胁人类健康，因此对细胞DNA损伤进行检测，并了解这一损伤能否引起细胞事件的变化就显得十分重要。
自从碱性彗星实验问世以来，各相关实验室已将该技术广泛应用于检测细胞DNA的损伤，与此同时，也在不断的对该方法进行改良，使之能够检测细胞内不同的DNA损伤，例如单双链的断裂、碱基的氧化损伤、DNA-DNA/DNA-蛋白质-药物交联以及修复等。
该方法将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后在电场中进行短时间的电泳，再用荧光染料染色。DNA受损细胞中形成DNA降解片段，在电场中泳动速度较快，使细胞核呈现出一种彗星式的图案，而正常的无DNA断裂的核在泳动时保持圆球形，是一种非常简便的检测细胞损伤的方式。
当前操作中，一般的单细胞DNA损伤的检测，采用一层凝胶，在电泳的过程中，该层凝胶太薄易脱落。若直接将凝胶层加厚，既容易因胶层过厚不易观察，又无法使细胞尽可能的处于同一个平面；若采用多层凝胶叠加的方式，两层胶面之间无法很好附着，脱胶现象依然存在。此外，当前所用细胞裂解液，含有用来破坏细胞膜的磷脂双分子层的肌氨酸钠，该物质在水中溶解度较低，导致裂解液配置时一直存在溶解性不佳的问题。
发明内容
本发明是为解决上述技术问题进行的，对当前的单细胞DNA损伤检测体系进行改进，提供了一种单细胞DNA损伤的快速检测方法及试剂盒，解决胶易脱落以及溶液配置困难的问题。
本发明的第一方面，提供了一种单细胞DNA损伤的快速检测方法，包括如下步骤：
A、铺胶
铺第一层胶，将电泳载玻片置于75％乙醇溶液中浸泡1～2h后擦干；铺胶前将载玻片在火焰上烤一遍，在受炙面的一端滴加普通琼脂糖凝胶0.1～0.3mL，用涂布棒水平铺拉凝胶到另一端，然后烤干，备用。
具体操作上，载玻片选择光面载玻片，尺寸为25mm×50mm×2mm；铺胶前，先将普通熔点的琼脂糖凝胶在75℃水浴锅中预热；铺胶后，采用涂布棒将普通琼脂糖凝胶涂匀后，采用酒精灯外焰烤干，烤干后能够长期保存，即用即取，直接进行第二层铺胶即可。
铺第二层胶：取30～50μL细胞悬液与150～250μL 1％低熔点琼脂糖凝胶吹打混匀，再取混合液滴在铺有底胶载玻片的一侧，用盖玻片从有胶的一侧缓缓放下，而后移去盖玻片。
具体操作上，该1％低熔点琼脂糖的配制方法如下：称量低熔点琼脂糖，加入体积为琼脂糖质量100倍的PBS溶液，置于37℃水浴锅中溶解。
细胞悬液与1％低熔点琼脂糖凝胶混匀后，混合液分五滴滴在铺有底胶载玻片的一侧，盖玻片盖上后，载波片系统被置于4℃条件下10～12min后，用水平推移的方法移去盖玻片。
B、裂解、解旋
使用表面滴加的方式，向步骤A中铺好细胞的载玻片上滴加裂解液100～500μL，用无菌水漂洗3次，将载玻片并列置于水平电泳槽内，电泳槽放于4℃，加入电泳缓冲液没过载玻片，浸泡20min，使DNA双链解螺旋，
细胞裂解液的配制方法如下：称量Tris 0.12～0.15g、NaOH 0.8～1.0g、NaCl14.5～15.0g、Na2EDTA3.72～4.0g置于烧杯中，加入80mL去离子水并用玻璃棒搅拌均匀使其完全溶解，调pH至10后定容至100ml，存放于4℃条件待用，用前加入曲拉通100和二甲基亚砜，终浓度均为1％。
发明人通过实验，配置细胞裂解液时，省去常用来破坏细胞膜的磷脂双分子层的肌氨酸钠，既保持了裂解液对细胞膜的破坏，又解决了配裂解液时不好溶解的问题。
C、电泳、染色及分析
在4℃、260～320mA恒定电流情况下进行碱式电泳，电泳结束后，依次采用中和缓冲液以及双蒸水进行中和及浸泡，而后进行染色和荧光拍片分析。
其中，碱性电泳缓冲液的配置方法如下：称量Na2EDTA 0.37～0.5g、NaOH12.0～15.0g置于烧杯中，加入800mL去离子水并用玻璃棒搅拌均匀使其完全溶解，调pH至13后定容至1L，存放于4℃。
中和缓冲液的配置方法如下：称量Na2EDTA4.85～5.0g置于烧杯中，加入80mL去离子水并用玻璃棒搅拌均匀使其完全溶解，调pH至7.5后定容至100mL，现配现用。
电泳时，电泳槽中的电泳缓冲液的液面比载玻片高出1～2cm；电泳结束后，用中和缓冲液中和3次，每次5min，接下来用双蒸水浸泡3次每次10min。载玻片用无菌水浸泡三次后，用滤纸吸干玻片上的液体后放在37℃恒温箱中烘干，能够不受时间的限制，随时拿出来染色采集荧光图片。
进行染色和荧光拍片分析的步骤如下：暗环境中，取稀释好的碘化丙啶染液10～20μL滴在烘干的载玻片上，以避免任何气泡产生的方式盖上盖玻片染色30min；将载玻片编为盲片，置于荧光显微镜下，选用×20倍物镜，每张片子随机拍照10～20个视野，计数拖尾细胞以及细胞拖尾率；再选择接近于视野中心、染色清晰、拖尾形态在目标样品中占优势的60～80个左右拖尾细胞，通过SCGE图像分析系统CASP测量并计算尾长、尾/头、尾/头％DNA以及尾距。
碘化丙啶染液的配制方法如下：称量碘化丙啶试剂20～25mg于棕色试剂瓶中，加入10～50mL pH7.4的PBS溶液置于涡旋振动器上充分震荡混匀后配置成2mg/ml的溶液，于4℃保存待用；碘化丙啶工作液为用PBS溶液稀释40倍使用。
本发明的第二方面，提供了一种单细胞DNA损伤的快速检测试剂盒，内含涂覆有底胶的载玻片、盖玻片、低熔点琼脂糖凝胶、曲拉通100、二甲基亚砜、NaCl、Na2EDTA、NaOH、PBS溶液、Tris、碘化丙啶试剂。进行单细胞DNA损伤时，从中选取所需的试剂进行溶液配置。
发明技术效果
首先，铺胶时，采用两层胶法，铺第一层时，铺胶前将载玻片在火焰上烤一遍，在受炙面的一端滴加普通琼脂糖凝胶，用涂布棒水平铺拉凝胶到另一端，然后烤干、备用，而后按照正常步骤进行第二层铺胶。两层胶法既能使胶面很好的附着，又能使细胞尽可能的处于同一个平面，效果较好，同时第一层胶烤干后，可能够长期保存，即用即取，直接进行第二层铺胶即可，简单便易。
其次，本发明配置细胞裂解液时，省去了常用来破坏细胞膜的磷脂双分子层的肌氨酸钠，既依旧保持了裂解液对细胞膜的破坏，又解决了配裂解液时不好溶解的问题。
第三，本发明经电泳和中和操作后处理后的载玻片可以即用即取，彗星电泳后的载玻片长期保存，随时拿出来染色采集荧光图片。
因此，本发明提供了一种检测单细胞DNA损伤的更加简便的方法，解决了检测过程中易脱胶，不易观察，不易操作等问题，使检测更易操作，且使操作更加灵活，方便，随取随测。
附图说明
图1是采用本发明方法进行HepG2细胞单细胞DNA损伤的彗星实验检测结果：(A)为不同药物剂量处理后细胞的彗星图像，(B)为不同药物剂量处理条件下，细胞的彗星阳性比例。
图2为CASP软件分析过程。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例一单细胞DNA损伤的快速检测方法
1、铺胶
制胶前准备：操作前半小时打开75℃和37℃的水浴锅。
第一层胶：第一层胶即底胶，选择光面的载玻片，先将所有的载玻片洗净放在酒精中浸泡1h后用擦镜纸擦干；点上酒精灯，铺胶前将载玻片在火焰上烤一遍，在受炙面的一端滴加在75℃水浴锅中预热的普通熔点的琼脂糖凝胶0.1～0.3mL，马上用三角玻璃棒水平铺拉凝胶到另一端，进而用酒精灯外焰烤干，备用。
第二层胶：取30～50μL细胞悬液与150～250μL 1％低熔点琼脂糖凝胶吹打混匀，再取混合液分5滴滴在铺有底胶载玻片的一侧，然后用盖玻片从有胶的一侧缓缓放下，不要有气泡产生，而后置于4℃环境中，10-12min后，用水平推移的方法移去盖玻片。
2、裂解、解旋
配制细胞裂解液：称量Tris 0.12～0.15g、NaOH 0.8～1.0g、NaCl 14.5～15.0g、Na2EDTA3.72～4.0g置于烧杯中，加入80mL去离子水并用玻璃棒搅拌均匀使其完全溶解，调pH至10后定容至100ml，存放于4℃条件待用，用前加入曲拉通100和二甲基亚砜，终浓度均为1％。
将铺好细胞的载玻片，使用表面滴加的方式，滴加裂解液100～500μL，用无菌水漂洗3次，将载玻片并列置于水平电泳槽内，电泳槽放于4℃，加入电泳缓冲液没过载玻片，浸泡20min,使DNA双链解螺旋。
3、电泳、中和
在4℃、260～320mA条件下电泳10min。电泳后，用中和缓冲液中和3次，每次5min，再用无菌水浸泡3次每次10min。用滤纸吸干玻片上的液体后放在37℃恒温箱中烘干。烘干后，能够不受时间的限制，随时拿出来染色采集荧光图片。
碱性电泳缓冲液的配置方法如下：称量Na2EDTA0.37～0.5g、NaOH 12.0～15.0g置于烧杯中，加入800mL去离子水并用玻璃棒搅拌均匀使其完全溶解，调pH至13后定容至1L，存放于4℃。
中和缓冲液的配置方法如下：称量Na2EDTA4.85～5.0g置于烧杯中，加入80mL去离子水并用玻璃棒搅拌均匀使其完全溶解，调pH至7.5后定容至100mL，现配现用。
4.染色、荧光拍片分析
取稀释好的PI染液10～20μL滴在烘干的载玻片上，盖上盖玻片(避免任何气泡)染色30min。以上各步骤均在暗环境中操作，避免光对DNA的额外损伤。每个剂量组做3次重复。将载玻片编为盲片，置于荧光显微镜下(物镜×20倍)，每张片子随机拍照10～20个视野(视细胞多少而定)，计数拖尾细胞，计算细胞拖尾率(形状指标)，拖尾率＝(拖尾细胞数/观察细胞数)×100％。再选择接近于视野中心、染色清晰、拖尾形态在目标样品中占优势的60～80个左右拖尾细胞，通过SCGE图像分析系统CASP测量并计算尾长、尾/头(长)、尾/头％DNA、尾距等较为客观的距离指标和复合指标。
实施例二验证实验
1、实验细胞
选择HepG2细胞作为实验对象。
2、供试细胞准备及损伤处理
取对数生长期的细胞制成细胞悬液，细胞经离心去掉胰酶与培养基后用新鲜培养基重新悬浮以供使用；调整细胞密度至1×105～1×106cells/ml(通过细胞计数仪进行技术)，接种于6孔细胞培养板后，待24h后光镜检测细胞确认其贴壁生长正常，弃去孔中培养基，准备药物染毒细胞后继续培养。
将药物的母液用HepG2细胞培养基稀释为对应浓度(5μM、10μM、20μM、40μM)的供试药液后，在准备好的细胞培养板中每孔加入2ml供试药液置于相应的培养箱中静置培养相应的时间。对照组以0.1％二甲亚砜为空白对照组，各组试验独立重复三次。
3、结果分析
采用实施例一中的方法进行检测，电泳过程中没有出现脱胶的情况。HepG2细胞染毒不同剂量的药物后，经过彗星实验、图像采集，然后用CASP软件分析。
随着药液浓度的增加，“彗星”尾矩逐渐延长(图1A)，细胞的彗星阳性比例也随着药液浓度的增加而增加(图1B)，说明细胞的DNA损伤程度与药液浓度呈正相关。本发明的细胞裂解液完全能够实现细胞裂解，不会对后续电泳和染色造成任何影响。
CASP软件分析的大体过程如图2所示。各实验材料的每个梯度在平行的实验条件下，重复三次，每个重复玻片取100-150个细胞，图像输入软件中分析记录数据。各细胞DNA彗星的头长度、尾部长度，头部DNA含量、尾部DNA含量、TM值、以及OTM即可由软件自动生成，其中的尾部长度，头部DNA含量、TM值是用以分析细胞DNA损伤的指标。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
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