一种提高钙质土壤中有机磷提取率以及液相31p-nmr检测效果的方法
技术领域
本发明涉及一种提高钙质土壤中有机磷提取率以及液相31P-NMR检测效果的方法，属于面向环境分析
技术领域
。背景技术
有机磷是植物的重要磷源，尤其随着全球磷矿资源的不断减少而日益受到重视。土壤有机磷的形态信息对于理解有机磷素有效性和发掘有机磷库供农业生产所需的前提。但目前对其化学结构及其生物有效性仍然知之甚少，其主要原因是由于分析方法上的局限性。31P-NMR技术为土壤中有机磷的表征和鉴定提供了有力的手段，然而测试前必须从土壤中提取有机磷，才能对其进行量化和鉴定，以便于后续形态和生物有效性的研究。土壤有机磷化学表征的理想萃取剂应最大程度地提高回收率，同时尽量减少化学结构的改变。
当前应用最广泛的提取方法是EDTA-NaOH一步提取法，碱性溶剂中EDTA通过螯合金属阳离子提高了土壤有机磷的提取率。但对于钙质土壤，其含有大量可溶性钙离子，在用碱溶液进行提取时易生成钙盐沉淀，进而导致有机磷固定而降低有机磷提取率。因此，有必要改进钙质土的有机磷提取率方法，这对准确的评估钙质土中磷储量、形态及其生物有效性具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高钙质土壤中有机磷提取率以及液相31P-NMR检测效果的方法，本发明方法对钙质土进行酸化预处理，通过使可溶性碳酸钙离子化，再用超纯水清洗由此可将土壤中大量钙离子去除；然后采用EDTA-NaOH溶液进行提取，提取液冻干后用碱溶液进行复溶，从而提高钙质土有机磷提取率，并在溶液31P-NMR中获得更佳的光谱分辨率。
本发明首先提供一种钙质土壤中有机磷的提取方法，包括如下步骤：
S1、将酸加入至钙质土壤中进行反应，用水洗涤后得到沉淀物；
S2、向经冻干后的所述沉淀物中加入Na2EDTA-NaOH提取剂进行提取，依次经振荡、离心和过滤得到有机磷提取液，即实现所述钙质土壤中有机磷的提取；
可采用0.5~1ml有机磷提取液，经稀释后用于有机磷含量的测定；
所述Na2EDTA-NaOH提取剂指的是Na2EDTA与NaOH的混合水溶液。
上述的提取方法中，步骤S1中，所述酸为盐酸、硝酸和硫酸中任一种，优选盐酸；
所述酸的浓度为1.44M、2.88M、4.32M或5.78M，优选2.88M。
所述钙质土壤与所述酸的质量配比为1：5~10，优选为1：8；
上述的提取方法中，步骤S1中，加入所述酸后，摇晃5~10min，静置至无气泡产生；然后离心10~15min后得到所述沉淀物；
采用水洗涤所述沉淀物至中性。
上述的提取方法中，步骤S2中，所述Na2EDTA-NaOH提取剂中，所述Na2EDTA的摩尔浓度可为0.01~0.1M，优选为0.05M，所述NaOH的摩尔浓度为0.1~0.5M，优选为0.25M。
上述的提取方法中，步骤S2中，所述提取的条件如下：
所述沉淀物与所述Na2EDTA-NaOH提取剂的质量配比为1：10~20，优选为1：10（根据样品有机物含量调整）；
所述振荡的条件为：温度为20~25℃，时间为6~16h，优选在20℃的条件下下震荡6h；
所述离心的条件为：转速为4500~5000r/min，时间为10~20min，优选在4800 r/min的条件下离心20min。
在上述提取方法的基础上，本发明进一步提供了钙质土壤中有机磷的液相31P-NMR检测方法，包括如下步骤：
所述有机磷提取液经冻干后复溶，即可进行液相31P-NMR检测。
上述的检测方法中，进行冻干之前，采用0.45um滤膜过滤所述有机磷提取液；
上述的检测方法中，复溶于D2O、H2O、Na2EDTA-NaOH提取剂与NaOH的混合液中，如0.65 ml D2O、0.65 ml H2O、0.65ml 0.05 M Na2EDTA-0.25 M NaOH、0.4 ml 10 M NaOH水溶液，旋涡震荡10min，然后加入至5mm核磁管中，上机测试。
进行液相31P-NMR检测时，测试参数如下：D1=5s，TD=16400，TE=293 K，P1=70 usec，NS=3000~6000，其余参数参照机器自动设定。
本发明验证了本发明方法中酸预处理步骤对土壤中磷化学结构的影响，可按照下述步骤进行：选取典型土壤有机磷标样，分别按照本发明提取方法和仅采用Na2EDTA-NaOH提取剂的方法进行提取，并用NMR检测这两种方式中土壤磷化学结构的变化，实验结果表明，有机磷标样在上述三种处理环境中，仅硝酸处理会影响有机磷化学结构，而盐酸、硫酸两种酸处理对有机磷化学结构无影响，可满足后续核磁分析测试。
具体地，土壤磷标样可为植酸（IHP）、葡萄糖6磷酸（G-6-P）、脱氧核糖核苷酸（DNA）。
具体地，可按照下述步骤实现本发明方法的模拟：取0.03g所述土壤有机磷标样（由于溶解性原因DNA为0.01g），溶于1ml酸中，充分混合；再加入1ml相应浓度的NaOH，中和溶液到中性；另加1ml的0.75M NaOH-0.15M EDTA提取剂（此处制备3倍浓度的NaOH-EDTA，以还原实际提取环境pH）；
可按照下述步骤实现仅采用Na2EDTA-NaOH提取剂的方法的模拟：取0.03g或0.01g所述土壤磷标样，溶于3ml 0.25M NaOH-0.15M EDTA溶液中，充分混合。
按照下述步骤实现干燥物复溶环境的模拟：取上述两种模拟提取液各0.65ml，分别溶于0.65ml H2O，0.65ml D2O，0.4ml 10M NaOH混合液中。
经验证，2.88M HCl的预处理效果最好，本发明方法能够提高钙质土壤中有机磷提取率以及液相31P-NMR检测效果：酸预处理能够显著提高NaOH-EDTA有机磷提取率；同时NMR结果也显示酸预处理与NaOH-EDTA一步提取法相比有机磷种类增加。因此本发明方法可提高NMR谱图中有机磷特征峰的识别程度；
具体可采用ICP测定总磷含量，采用钼蓝比色法测定无机磷含量，差减法得有机磷含量。
本发明方法适用于河南、陕西等地的钙质土壤中有机磷的提取和检测。
与现有技术相比，本发明方法具有如下有益效果：
（1）可显著提高钙质土壤的有机磷提取量，尤其是磷酸单酯。
（2）可提高NMR谱图有机磷特征峰的识别程度。
附图说明
图1为本发明
具体实施方式
中三种典型土壤有机磷标样在三种环境中土壤磷化学结构对比。
图2为陕西、河南两种高钙质土经酸预处理与EDTA-NaOH一步提取后的NMR图谱。
图3为不同浓度盐酸处理后土壤中各类磷形态含量。
图4为不同种类酸处理后土壤中各形态磷含量。
图5为不同浓度酸预处理后NaOH-EDTA提取出中各磷形态含量。
图6为不同种类酸预处理后NaOH-EDTA提取出中各磷形态含量。
图7为NaOH-EDTA提取后土壤残渣中各种磷形态含量。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 钙质土壤中有机磷的提取及检测
1）不同浓度酸预处理
将1.44M、2.88M、4.32M、5.76M的HCl按1：8的土液比加入到取自陕西、河南的钙质土壤中，摇晃10min，静置至无气泡产生；离心10min，5000r/min，用去离子水清洗5次至pH＞5，并收集每次清洗液，得到目标沉淀物并冻干。
2）不同种类酸预处理
将1.44M HCl、HNO3和0.72M H2SO4按1：8的土液比加入到取自陕西、河南的钙质土壤中，摇晃10min，静置至无气泡产生；离心10min，5000r/min，用去离子水清洗5次至pH＞5，并收集每次清洗液，得到目标沉淀物并冻干。
3）NaOH-EDTA提取
将上述离心沉淀物冻干，以1：10的土液比，加入0.05M Na2EDTA-0.25M NaOH进行提取，于20℃下震荡6h，离心20min，4800r/min，经过滤得到的有机磷提取液，过0.45um滤膜后备用。
3）取lml有机磷提取液用于测定有机磷含量，剩余部分冻干。冻干物进行复溶，复溶于0.65ml D2O，0.65ml H2O，0.65ml 0.05M Na2EDTA-0.25M NaOH，0.4ml 10M NaOH，漩涡震荡10min，混合液至5mm核磁管中，进行NMR分析。
NMR分析的条件：D1=5s，TD=16400，TE=293K，P1=70usec，NS=3000~6000，其余参数参照机器自动设定。
对比例1 钙质土壤中有机磷的提取及检测
1）NaOH-EDTA提取
取陕西、河南的钙质土壤，以1：10的土液比，加入0.05M Na2EDTA-0.25M NaOH进行提取，于20℃、200r/min震荡6h；离心20min，4800r/min，经过滤得到的有机磷提取液，过0.45um滤膜后备用。
2）取lml有机磷提取液用于测定有机磷含量，剩余部分冻干。冻干物进行复溶，复溶于0.65ml D2O，0.65ml H2O，0.65ml 0.05M Na2EDTA-0.25M NaOH，0.4ml 10M NaOH，漩涡震荡10min，混合液至5mm核磁管中，进行NMR分析。
NMR分析的条件：D1=5s，TD=16400，TE=293K，P1=70usec，NS=3000~6000，其余参数参照机器自动设定。
原始土壤及不同浓度盐酸处理后各形态磷的含量，结果如图3所示。
由图3中的数据可知，总磷与无机磷含量与酸浓度基本上是呈负相关关系的，有机磷在用1.44M和2.88M HCl处理时损失量较小。据此确定合适的酸浓度为1.44M和2.88M。
不同种类酸处理后土壤中各形态磷含量，结果如图4所示。
由图4中的数据可知，盐酸和硝酸的处理效果要好于硫酸，特别是在河南土中，经硫酸处理后有机磷损失量最多。据此确定合适的酸为盐酸和硝酸。
经不同浓度的盐酸预处理后NaOH-EDTA提取出的各磷形态含量，结果如图5所示。
由图5中的数据可知，经2.88M HCl预处理后的土壤，再进行NaOH-EDTA提取时，有机磷的提取量最多，结合图3，最合适的酸浓度为2.88M。
经不同种类酸预处理后NaOH-EDTA提取出中各磷形态含量，结果如图6所示。
由图6中的数据可知，HCl与HNO3预处理后，提取有机磷的量高于H2SO4提取。据此更进一步确定最合适的酸种类为HCl或HNO3。
经由HCl或HNO3预处理土壤、NaOH-EDTA提取后土壤残渣中各磷形态含量，结果如图7所示。
由图7中的数据可知，HCl或HNO3预处理土壤，有机磷的残留量相差不大。基于以上数据可知2.88M的HCl和HNO3作为前处理剂最合适。
为了验证本发明方法中盐酸和硝酸预处理步骤对土壤中磷化学结构的影响，按照下述步骤进行：选取典型土壤有机磷标样（植酸（IHP）、葡萄糖6磷酸（G-6-P）、脱氧核糖核苷酸（DNA）分别按照本发明提取方法和仅采用Na2EDTA-NaOH提取剂的方法进行溶解，并用NMR检测这两种方式中土壤磷化学结构的变化。
按照下述步骤实现本发明方法的模拟：取0.03g土壤有机磷标样（由于溶解度低DNA取0.01g），溶于1ml 2.88M HCl和HNO3中，充分混合；再加入1ml 2.88M的NaOH，中和溶液到中性；另加1ml的0.75M NaOH-0.15M EDTA提取剂（此处制备3倍浓度的NaOH-EDTA，以还原实际提取环境pH）；
按照下述步骤实现仅采用Na2EDTA-NaOH提取剂的方法的模拟：取0.03g土壤有机磷标样（DNA取0.01g），溶于3ml 0.25M NaOH-0.15M EDTA溶液中，充分混合。
取0.65ml上述两种状态中标样制备液，再加入0.65 ml D2O，0.65ml H2O，0.4ml10M NaOH，混匀，进行NMR分析。
NMR分析的条件：D1=5s，TD=16400，TE=293K，P1=70usec，NS=300，其余参数参照机器自动设定。
三种典型土壤有机磷标样在三种环境中磷化学结构对比如图1所示，其中，A表示HNO3酸化处理再碱溶液提取，B表示先HCl酸化处理再碱溶液提取，C表示碱溶液一步提取。
由图1数据可得知：
预处理对磷化学结构的影响：选取三种典型土壤有机磷标样，模拟先酸化处理再碱溶液提取、及碱溶液一步提取，并用NMR检测这三种环境中土壤磷化学结构的变化，结果发现磷标样在三种处理环境中，HNO3处理的标样化学结构改变，尤其是DNA，这可能是因为HNO3的氧化作用导致有机磷的分解；盐酸处理对样品的影响较小。
陕西、河南两种高钙质土经盐酸预处理（实施例1）与EDTA-NaOH一步提取（对比例1）的NMR图谱如图2所示，图中标注，如陕西-HCl表示经盐酸预处理，陕西代表EDTA-NaOH一步提取，陕西-HNO3表示经硝酸预处理，其中，HCl的浓度为2.88M，HNO3的浓度为2.88M。
由图2数据可得知：HCl预处理会去掉大量无机磷，在用相同浓度的HNO3处理后土壤中剩余的无机磷却多于HCl处理，这说明硝酸不仅有酸化作用同时还具有氧化作用，使其他有机磷被氧化为正磷酸盐。并且HCl预处理与传统NaOH-EDTA提取法相比，可被检测到的有机磷的种类增加。
综上分析，优选2.88M HCl作为预处理剂。
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