一种原生动物包囊透射电镜样品的制备方法
技术领域
本发明涉及一种透射电镜样品的制备方法，具体涉及一种原生动物包囊透射电镜样品的制备方法，属于透射电镜样品制备
技术领域
。背景技术
原生动物的包囊主要分为“休眠包囊”、“传染包囊”和“繁殖包囊”三种。“休眠包囊”是原生动物为应对不利环境而形成的一种休眠态，常见于营自由生活的纤毛虫(包囊游仆虫和冠突伪尾柱虫等)；“传染包囊”是高等动物寄生虫生活史中的传播阶段，其几丁质包囊壁具有耐酸性，可防止虫体被宿主消化(痢疾内变形虫和兰帕贾第虫等)；而与上述两种不同的是，发生正常细胞分裂并产生幼虫的包囊是“繁殖包囊”，是生物生活史中的一个特定变态时期，是在离体情况下自发调控形成的。该类型的包囊常见于鱼类的寄生原生动物中，如多子小瓜虫、眼点淀粉卵涡鞭虫和刺激隐核虫等。对原生动物包囊的研究目前已引起足够的重视。多年来，许多研究重点关注包囊的结构及形成，细胞皮层纤毛小器官的脱分化和再分化，以及各种包囊现象与原生动物系统进化的联系。特别是研究包囊的内部细微结构特点，有助于深入了解寄生虫的发育规律，为病害的防治提供理论依据，为新的研究手段和药物的开发提供新的思路，并且能够有效的说明寄生虫地域差异和生物进化中的许多机制，为开发生物能源和促进大自然的生态平衡等提供科学的基础，因此如何借助现代科学技术方法研究微观世界的奥妙是十分重要的。
透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy，TEM)是研究生物超微结构的一项重要工具。其分辨率高达0.2nm，可以观测到大部分细胞的微小结构，满足单细胞微生物的观测需求，应用范围极广。透射电镜成像是通过电子枪发出高速电子束经过1-2级聚光镜会聚后均匀照射到样品的观察区上，入射电子与样品发生碰撞与非碰撞，由于样品很薄，大部分电子穿透过样品，其强度分布与所观察样品区的形貌、组织、结构一一对应。投射出样品的电子经过物镜、中间镜和投影镜的三级磁透镜放大投射在观察图像的荧光屏上，荧光屏把电子强度分布转化为人眼可见的光强分布，在荧光屏上显出与样品形貌、组织、结构相应的图像以供实验所需。
TEM样品制备好坏是能否准确观察到细胞中的微观结构的重要前提。传统的透射电镜超薄切片的制样过程一般包括取样、固定、浸洗、脱水、包埋、渗透、聚合、切片及染色等步骤。虽然制样方法具有单一性，但是样品的多样性使制样结果参差不齐。由于原生动物包囊结构的特殊性，在细胞的外围形成了一圈“包囊壁”。包囊壁是原生动物细胞的衍生物，是细胞的“铠甲”，他为细胞提供了一个保护性的微环境，可阻隔掉大量化学药物等不利因素对原生质体的伤害。原生动物的包囊壁一般为形态各异的多层结构，不同的生物组成各不相同。如刺激隐核虫的包囊壁在形态上是一个厚约4μm，由3个不同电子密度区域构成的多片层结构，中间部分较为紧实，厚约为包囊壁的一半，内侧和外侧的结构较为疏松。
因此要想使用透射电镜的方法观察包囊的内部微观结构，样品制备方法和技巧将成为制样是否成功的关键。要想制备出好的样品，得到清晰可视的图像则需要克服以下多种困难：1.保证样品的尺寸是最佳大小；2.固定液能够快速穿过包囊壁渗透到包囊的内部；3.脱水剂能够在较短的时间内进入包囊并取代细胞中的游离水；4.包埋剂能够充分渗透进入包囊等。只要其中的某一个步骤没有处理好，都将导致制样失败，所得的内部结构出现不同程度的降解。然而，就目前的实验方法和操作技术来看，制作的原生动物包囊电镜样品的质量鱼龙混杂，包囊内部经常出现不同程度的空洞，难以准确并大视野的观察包囊内部的细胞器结构，细胞的超微结构难以清晰呈现，失败率较高。并且没有一套较为标准的制样方法，制样往往是凭借个人经验，所得的结果存在不稳定性，不可重复性等特点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的制备原生动物包囊TEM样品时存在的包囊内部降解、失败率高、细胞的超微结构难以清晰呈现、制样结果的不稳定性和不可重复性等技术不足，而提供一种原生动物包囊透射电镜样品的制备方法。本发明通过多次的实验检验，结合实验经验，根据原生动物包囊的特性，在传统的样品制备方法上，对包囊固定的方法及包埋剂的选择进行优化，并对浸洗、脱水、包埋的时间进行改进，增加了部分制样过程中的技巧，能够使包囊的超微结构完整清晰呈现，结果稳定，重复性强，解决了以往制样中细胞质大量降解等技术问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种原生动物包囊透射电镜样品的制备方法，包括以下步骤：
选取需要的原生动物包囊期细胞或实验处理后的包囊作为样品，利用固定液I对选取的包囊进行固定处理，固定处理结束后利用漂洗液对固定的包囊进行漂洗处理，漂洗处理结束后再利用固定液II对漂洗后的包囊进行二次固定处理，二次固定处理结束后利用漂洗液对二次固定处理后的包囊进行二次漂洗处理，二次漂洗处理结束后利用有机溶剂对二次漂洗处理后包囊进行脱水处理，脱水处理结束后利用利用包埋剂对脱水后包囊进行渗透、包埋处理，包埋处理结束后依次对包囊进行聚合、切片、染色处理，得到原生动物包囊透射电镜样品，最后对得到原生动物包囊透射电镜样品进行验证观察。
上述技术方案中，所述的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)取样：
选取需要的原生动物包囊期细胞或实验处理后的包囊作为样品，选取的包囊为休眠包囊、传染包囊或繁殖包囊的单个包囊，选取的单个包囊直径不宜过大、但发育良好，并且在处理前在光学显微镜下观察包囊的发育情况是否为预期的效果；
(2)固定处理：
将步骤(1)中选取的单个包囊转移到载玻片的一角，吸干多余的培养液，利用固定液I将包囊冲洗至装有少量固定液I的玻璃固定缸中(当包囊冲入固定缸之后，整个包囊都浸泡在固定缸中)，小心的震荡玻璃固定缸中的包囊5min；然后，将样品小心的转移至2mL的离心管中并加入1mL固定液I，室温下静置1小时；随后将样品转移至4℃冰箱里避光固定处理24小时，固定处理时保持离心管平躺放置，有利于固定液与样品的充分接触；
(3)漂洗处理：
将步骤(2)中经过固定处理后得到的样品先利用灭菌海水漂洗一次，然后再利用漂洗液对样品漂洗三次，一共浸洗4次；每次漂洗时将样品放入均置仪中，加入灭菌海水或者漂洗液后进行震荡漂洗，每次浸洗前需小心的尽量吸干上一步骤中的灭菌海水或者漂洗液，震荡漂洗时在室温下进行；
(4)二次固定处理：
将步骤(3)中经过漂洗处理后得到样品中的漂洗液吸至只剩最后一滴，然后立即加入一滴固定液II，随后将样品转移至4℃冰箱里进行二次固定处理；二次固定处理时避光且保持离心管平躺放置，处理时间为1.5-2小时；
(5)二次漂洗处理：
将步骤(4)中经过二次固定处理后得到样品中的固定液II吸干，并立即加入漂洗液对样品漂洗三次；每次漂洗时将样品放入均置仪中，加入漂洗液后进行震荡漂洗，每次浸洗前需小心的尽量吸干上一步骤中的漂洗液；
(6)脱水处理：
将步骤(5)中经过二次漂洗处理后得到样品中的漂洗液吸干，先利用由低至高不同浓度的酒精对样品进行逐级脱水处理，然后再利用由低至高不同浓度的丙酮继续对样品进行逐级脱水处理，取代样品中的游离水；
(7)包埋处理：
将步骤(6)中经过脱水处理后得到的样品利用不同浓度的包埋剂进行逐步的组织渗透处理；
(8)聚合处理：
将步骤(7)中经过包埋处理后得到的样品在70℃下聚合24小时，然后在60℃下处理36小时；
(9)切片：
切片包括修块和切片，将经过步骤(8)聚合处理后得到的样品从离心管中取出磨成适合切块的长度，长度为1cm，随后在切片机上进行连续超薄切片；
(10)染色处理：
将步骤(9)切片后得到的超薄切片利用染色剂进行染色，使重金属盐与细胞的一些结构和成分结合，增加电子的散射能力，进而达到提高反差的目的，使呈现的图片清晰可见；染色结束后将得到的样品放置在透射电镜上，上样观察对制样结果进一步检验。
上述技术方案中，步骤(2)中，所述的固定液I是由质量浓度为3％的戊二醛(Glutaraldehyde 25％EM grade)、质量浓度为0.3％的Tritan X-100和盐度为22％的灭菌海水混合后得到的溶液，三者的体积比为12:3:85。
上述技术方案中，步骤(3)中，所述的灭菌海水为盐度22‰的灭菌海水，所述的漂洗液为0.1mol/L PBS溶液；每次漂洗时将样品放入均置仪中，向离心管中加入800μL的灭菌海水或者漂洗液后进行震荡漂洗，每次震荡漂洗的时间为15分钟；均置仪进行震荡漂洗时，转速为2400r/min，30s×3循环。
上述技术方案中，步骤(4)中，所述的固定液II为质量浓度为1％的锇酸溶液(SPI-ChemTM)。
上述技术方案中，步骤(5)中，所述的漂洗液为0.1mol/L PBS溶液，每次漂洗时将样品放入均置仪中，向离心管中加入800μL的漂洗液进行震荡漂洗，每次震荡漂洗的时间为15分钟；均置仪进行震荡漂洗时，转速为2400r/min，30s×3循环。
上述技术方案中，步骤(6)中，所述的脱水处理，具体包括以下步骤：
①将步骤(5)中经过二次漂洗处理后得到样品中的漂洗液吸干，向离心管中加入800μL质量浓度为30％的酒精,室温下在震荡仪上处理20分钟后吸干；再向离心管中加入800μL质量浓度为50％的酒精，室温下在震荡仪上处理20分钟后吸干；继续向离心管中加入800μL质量浓度为70％的酒精，室温下在震荡仪上处理20分钟后吸干；最后向离心管中加入800μL浓度为90％的酒精，室温下在震荡仪上处理20分钟后吸干，从而完成不同浓度的酒精对样品的逐级脱水处理；
②将经过不同浓度的酒精逐级脱水处理后的包囊转移到1mL的离心管中利用丙酮继续脱水(转移时切勿损伤样品)：向离心管中加入400μL质量浓度为90％的丙酮，室温下在震荡仪上处理10分钟后吸干；然后向离心管中加入400μL无水丙酮，室温下在震荡仪上处理10分钟后吸干；重复无水丙酮脱水步骤三次，最后一次吸至剩三滴无水丙酮为止，从而完成不同浓度的丙酮对样品的逐级脱水处理；
本步骤中，不同浓度的酒精和丙酮都是现用现配的。
上述技术方案中，步骤(7)中，所述的逐步的组织渗透处理，包括以下步骤：
①向经过脱水处理后得到样品中加入1.5滴包埋剂，使体系内的包埋剂与丙酮的质量比为1：2，盖上盖子进行渗透处理2小时；
②向步骤①体系中加入一滴半包埋剂，使体系内的使包埋剂与丙酮的质量比为1：1，盖上盖子进行渗透处理2小时；
③将步骤②体系中先前所加的所有液体小心吸出，加入包埋剂500μL，抽真空30分钟后进行聚合处理；
步骤①—③中的包埋剂为Spurr包埋剂。
上述技术方案中，步骤(10)中，所述的染色剂为醋酸双氧铀(TED PELLA)和柠檬酸铅(Merck KGaA)，按照传统的双色染色法先进行醋酸双氧铀染色然后进行柠檬酸铅染色。
上述技术方案中，所述的均置仪和震荡仪的使用目的是一样的，均置仪是短暂的快速震荡，而震荡仪的振荡是持续而慢速的，但是，都是为了充分处理。
现有技术中对于原生动物电镜样品的制备，一般以整个细胞作为样品进行制备；包囊虽然是细胞的一部分，但是他具有特殊结构——包囊壁，阻碍了固定液、漂洗液或者包埋剂等化学药品的渗透，对样品的制备带来很大的难题；而本发明为了克服这些技术难题，对传统方法进行了改进，与现有技术相比，具有以下技术效果：
(1)本发明提供了一套原生动物包囊透射电镜样品较为标准的制备方法，使包囊细胞超微结构清晰完整呈现，该方法具有一定的稳定性和可重复性。
(2)本发明对传统的固定方法进行了改进，在不损害包囊的情况下，利用戊二醛和Tritan X-100共同处理包囊，前者起到固定的作用，后者不仅具有增加包囊壁通透性的特性，且对原生动物没有杀伤作用，能够促进固定液透过包囊壁，使样品快速固定，解决了以往样品固定不充分的困难。
(3)本发明利用植物细胞包埋剂(Spurr包埋剂)取代了传统制样方法中的动物细胞包埋剂(Epon812环氧树脂包埋剂)，使包埋剂能够更好的完全渗透进入包囊。
(4)本发明在过去的制样方法中，根据包囊的特性对各步骤中的处理时间进行了优化改进，在一些处理中运用了均置仪和震荡仪，有利于每一个步骤充分处理，增加了制样结果的有效性，为样品的清晰呈现提供了基础。
(5)本发明在制样的过程中，总结了以往学者们包囊制样失败的原因，对制样方法进行系统的改进，并结合个人前期制样的探索，总结了制样中的一些操作技巧，使特殊的原生动物包囊的制样有了较为稳定且可重复的特点。
(6)本发明可应用于大部分原生动物包囊TEM样品的制备，如刺激隐核虫、多子小瓜虫和包囊游仆虫等。
附图说明
图1为刺激隐核虫包囊利用传统制样方法得到的TEM图片(3％戊二醛固定+Epon812环氧树脂包埋剂)，放大倍数较小、视野较大；
图2为刺激隐核虫包囊利用传统制样方法得到的TEM图片(3％戊二醛固定+Epon812环氧树脂包埋剂)，放大倍数较大、视野较小；
图3为刺激隐核虫包囊利用传统制样方法得到的TEM图片(3％戊二醛固定+Epon812环氧树脂包埋剂)，放大倍数较大、视野较小(与图2的拍摄区域不同)；
图4为实施例1中刺激隐核虫包囊在传统方法上改进后的得到的TEM图片(3％戊二醛固定+Spurr包埋剂)，放大倍数较小、视野较大；
图5为实施例1中刺激隐核虫包囊在传统方法上改进后的得到的TEM图片(3％戊二醛固定+Spurr包埋剂)，放大倍数较大、视野较小；
图6为实施例1中刺激隐核虫包囊在传统方法上改进后的得到的TEM图片(3％戊二醛固定+Spurr包埋剂)，放大倍数较大、视野较小(与图5的拍摄区域不同)；
图7为实施例2刺激隐核虫包囊在传统方法上改进后的得到的TEM图片(3％戊二醛+0.3％的Tritan X-100混合溶液固定+Spurr包埋剂)，放大倍数较小、视野较大；
图8为实施例2刺激隐核虫包囊在传统方法上改进后的得到的TEM图片(3％戊二醛+0.3％的Tritan X-100混合溶液固定+Spurr包埋剂)，放大倍数较大、视野较小；
图9为实施例2刺激隐核虫包囊在传统方法上改进后的得到的TEM图片(3％戊二醛+0.3％的Tritan X-100混合溶液固定+Spurr包埋剂)，放大倍数较大、视野较小(与图8的拍摄区域不同)。
具体实施方式
以下对本发明技术方案的具体实施方式详细描述，但本发明并不限于以下描述内容：
下面结合具体的实施例，对本发明进行阐述：
实施例1：
对传统方法优化后，用灭菌海水稀释配置的浓度为3％的戊二醛作为固定液，并用植物组织包埋剂(Spurr包埋剂)取代动物组织细胞包埋剂(Epon812环氧树脂包埋剂)对刺激隐核虫包囊透射电镜超薄切片样品制备方法的具体步骤：
(1)选取单个隐核虫包囊且直径不宜过大，但发育良好，并且固定前在光学显微镜下观察包囊的发育情况是否为预期的效果；
(2)前固定：把(1)中选取的包囊转移到载玻片的一角，吸干多余的培养液，利用事先配置好的3％的戊二醛(Glutaraldehyde 25％EM grade)将包囊冲洗至装有少量混合固定溶液的玻璃固定缸中，小心的震荡固定缸中的样品5min后，将样品小心的转移至2mL的离心管中并加入1mL混合固定溶液，室温静置1小时，随后将样品转移至4℃储存24小时，用于下一步制样所需。整个处理过程保持避光且离心管平躺放置，有利于固定液与样品的充分接触。
(3)前浸洗：利用两种溶液(盐度为22‰灭菌海水和0.1mol PBS溶液)浸洗(2)中的包囊，每次浸洗前需小心的吸走上一步骤中的溶液(尽量吸干)，然后立即加入800μL下一次的浸洗液，一共浸洗4次(第1次利用灭菌海水，第2-4次利用PBS溶液)，每次浸洗15分钟，并且每次加入浸洗液后利用均置仪震荡(2400r/min，30s*3循环)。整个实验在室温下进行，且保证离心管平躺放置。
(4)后固定：将步骤(3)中的浸洗液吸至只有最后一滴，然后立即加入等体积1％的锇酸(SPI-ChemTM)，转移至4℃冰箱里避光固定2.5小时。
(5)后浸洗：将步骤(4)中的固定液吸干，并立即加入浸洗液(0.1mol PBS溶液)800μL，一共浸洗3次，每次15分钟，并且每次加入浸洗液后利用均置仪震荡(2400r/min，30s*3循环)。整个实验在室温下进行，且保持离心管平躺放置。
(6)脱水：利用两种有机溶液(不同浓度的酒精和丙酮，现配现用)处理步骤(5)中的包囊，取代其中的游离水。主要步骤如下：
a.把步骤(5)中的浸洗液吸干并加入800μL浓度为30％的酒精,室温下在震荡仪上处理20分钟后吸干；
b.加入800μL浓度为50％的酒精,室温下在震荡仪上处理20分钟后吸干；
c.加入800μL浓度为70％的酒精,室温下在震荡仪上处理20分钟后吸干；
d.加入800μL浓度为90％的酒精,室温下在震荡仪上处理20分钟后吸至一滴；
e.将上述包囊转移到1mL离心管中利用丙酮继续脱水(转移时切勿损伤样品)；
f.加入400μL浓度为90％的丙酮,室温下在震荡仪上处理10分钟后吸干；
g.加入400μL无水丙酮,室温下在震荡仪上处理10分钟后吸干，重复该步骤三次，最后一次吸至最后三滴无水丙酮为止。
(7)包埋：利用包埋剂(Spurr包埋剂)逐步渗透包囊。具体步骤如下：
a.向a中加入1.5滴包埋剂，使包埋剂/丙酮＝1/2，渗透2小时；
b.向a中加入一滴半包埋剂，使包埋剂/丙酮＝1/1，渗透2小时；
c.小心吸出b中先前所加的所有液体，加入包埋剂500μL，抽真空30分钟后取出，样品用于下一步操作。
(8)聚合：在70℃下聚合24小时。
(9)切片：包括修块和切片，将聚合好的样品从离心管中取出磨成适合切块的长度(约1cm)，随后在切片机上进行连续超薄切片。
(10)染色：为双染色，利用醋酸双氧铀(TED PELLA)和柠檬酸铅(Merck KGaA)，使重金属盐与细胞的某些结构和成分结合，增加电子的散射能力，进而达到提高反差的目的，使呈现的图片清晰可见。
(11)上样观察：在透射电镜(日立H-7650)上，上样观察对制样结果进一步检验，电镜图如图4-6所示，是利用3％戊二醛作为固定液，并利用Spurr包埋剂处理后的样品结果，与传统的方法(图1-3)相比，在电镜下观察，发现细胞的内部亚结构清晰可辨，并且细胞结构完整，细胞整体透明度提升，大小及形态分明；且从图中的细胞内部结构没有出现细胞质溶解呈现大量空洞等现象；多次重复操作后观测结果仍十分稳定，实验结果可靠。
实施例2：
对传统方法优化后，用3％戊二醛与0.3％Tritan X-100混合溶液固定作为固定液，并用植物组织包埋剂(Spurr包埋剂)取代动物组织细胞包埋剂(Epon812环氧树脂包埋剂)对刺激隐核虫包囊透射电镜超薄切片样品制备方法的具体步骤：
本实施例与实施例1中除了使用不同的固定液外(3％戊二醛与0.3％Tritan X-100混合溶液)其他处理基本相同，电镜图如图7-9所示，是利用3％戊二醛+0.3％的TritanX-100混合溶液作为固定液，并利用Spurr包埋剂处理后的样品结果，与传统的方法(图1-3)相比，在电镜下观察，发现细胞的内部亚结构清晰可辨，并且细胞结构完整，细胞整体透明度提升，大小及形态分明；且从图中的细胞内部结构没有出现细胞质溶解呈现大量空洞等现象；多次重复操作后观测结果仍十分稳定，实验结果可靠。
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
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